1、早期診斷和早期治療是改善癌癥患者的預(yù)后及降低其死亡率的關(guān)鍵所在。腫瘤標(biāo)志物在其中發(fā)揮著重要作用。除了傳統(tǒng)的腫瘤標(biāo)志物，近年來許多新的且有效的生物分子標(biāo)志物也相繼被學(xué)者發(fā)現(xiàn)，其中包括基因甲基化、多種基因突變、端粒酶、血中循環(huán)DNA及microRNA。眾多研究表明，以上幾種生物分子標(biāo)志物對癌癥早期診斷及預(yù)測的敏感性，特異性均不低于傳統(tǒng)標(biāo)志物。因此，上述幾種標(biāo)志物極可能被廣泛用于臨床上對癌癥的早期診斷、判斷預(yù)后、和評價治療效果。針對這一研究目

2、的，本論文旨在研究DNA與貴金屬納米粒子，熒光、電化學(xué)活性物質(zhì)等信號分子及生物大分子的組裝方法，利用其對信號分子的高負(fù)載量以及可以在其不同位點(diǎn)同時精確組裝幾種不同生物分子的特性，設(shè)計合成了多種DNA納米生物探針，構(gòu)建生物分子標(biāo)志物高靈敏、多組分同時檢測的新方法。本論文的主要內(nèi)容如下:
　　1.金納米粒子手性二聚體用于檢測DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性及其抑制劑
　　利用DNA誘導(dǎo)金納米粒子進(jìn)行手性組裝和限制性內(nèi)切酶HpaⅡ檢測DNA甲

3、基轉(zhuǎn)移酶活性及其抑制劑。首先，研究粒子尺寸和粒子間距對手性金納米粒子二聚體手性信號的影響，篩選出手性信號最強(qiáng)的金納米粒子二聚體作為DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的檢測探針。然后利用限制性內(nèi)切酶HpaⅡ可以識別并切斷二聚體之間的5'-CCGG-3'核酸序列，從而破壞二聚體結(jié)構(gòu)，手性信號減弱。如果有甲基轉(zhuǎn)移酶M.SssⅠ存在時，5'-CCGG-3'DNA序列被甲基化為5'-CCmGG-3'，限制性內(nèi)切酶HpaⅡ無法切斷此甲基化序列，因而完整的金納米粒子二

4、聚體依然保持很強(qiáng)的手性信號。該方法具有寬的線性范圍（0.5U mL-1到150U mL-1）、低的檢測限(0.27U mL-1)、高的選擇性及良好的穩(wěn)定性。同時，也用此方法評估了5-氮雜胞嘧啶核苷和普魯卡因?qū)谆D(zhuǎn)移酶的抑制效果?？偟膩碚f，此方法具有較好的準(zhǔn)確度，特異性，靈敏度，可以檢測血清樣本，有益于臨床診斷和藥物開發(fā)。
　　2.金納米粒子手性二聚體用于檢測8-羥基脫氧鳥苷
　　以8-羥基脫氧鳥苷的核酸適體組裝的金納米粒子

5、手性二聚體為信號探針，檢測DNA氧化應(yīng)激損傷的標(biāo)志物:8-羥基脫氧鳥苷。首先利用8-羥基脫氧鳥苷的核酸適體組裝金納米粒子二聚體。透射電鏡TEM可以觀察到金納米粒子二聚體的生成，CD光譜儀可以檢測到此二聚體具有很強(qiáng)的手性信號。當(dāng)溶液中含有檢測物8-羥基脫氧鳥苷時，檢測物會與其核酸適體結(jié)合，從而破壞二聚體結(jié)構(gòu)，手性信號減弱。通過此方法可以定量檢測0.05nM到2nM的8-羥基脫氧鳥苷，最低檢測線為33pM（信噪比為3）。同時，此方法可用于評

6、估人血清樣本中8-羥基脫氧鳥苷的含量?？偟膩碚f，此方法具有較好的準(zhǔn)確度，特異性，靈敏度，可以檢測血清樣本，有益于臨床診斷。
　　3.DNA正四面體探針用于端粒酶活性的電化學(xué)檢測
　　以DNA正四面體納米材料為基礎(chǔ)，研究其在電化學(xué)檢測腫瘤標(biāo)志物端粒酶中的應(yīng)用。在DNA正四面體的一個頂點(diǎn)引出端粒擴(kuò)增引物，其他三個頂點(diǎn)修飾巰基，通過金硫鍵將此探針共價修飾到金電極表面。當(dāng)端粒酶存在時，端粒酶特異性識別端粒引物，并在其3'末端擴(kuò)增出(

7、TTAGGG)x富G序列。該富G序列在鉀離子和氯化血紅素的作用下形成G-四鏈體，是一種具有類似辣根過氧化物酶催化性質(zhì)的DNA模擬酶。該DNA模擬酶在過氧化氫的存在下催化苯胺聚合成具有電化學(xué)活性的聚苯胺。利用示差脈沖伏安法檢測聚苯胺的電化學(xué)信號從而檢測端粒酶活性。通過調(diào)節(jié)DNA正四面體探針的尺寸，可以控制相鄰端粒引物的距離。當(dāng)此距離接近端粒酶的尺寸時，端粒酶識別端粒引物并進(jìn)行擴(kuò)增的效率大大增強(qiáng)，從而可以得到最佳的電化學(xué)輸出信號，顯著提高檢

8、測靈敏度。利用此方法，可以評估MCF-7，A549，MDA-MB-231，HeLa等細(xì)胞中的端粒酶活性。該方法的最低檢測限為1個細(xì)胞/10微升，檢測范圍為5到5000個細(xì)胞，與單鏈端粒引物探針相比，信號提高20倍。該方法用于檢測膀胱癌患者尿樣中脫落細(xì)胞的端粒酶活性時，得到的結(jié)果與臨床病理檢測結(jié)果一致。
　　4.基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)同時檢測三種與肺癌相關(guān)microRNA
　　設(shè)計三種不同熒光素(Cy3，Cy3.5，Cy5)

9、標(biāo)記的核酸探針，對應(yīng)識別三種microRNA（miRNA-155，miRNA-182，miRNA-197），形成雙螺旋核酸探針。核酸染料TOTO-1可以嵌入到核酸探針骨架中，通過單波長激發(fā)，將熒光共振能量轉(zhuǎn)移給相應(yīng)的熒光素，產(chǎn)生不同的熒光信號，實(shí)現(xiàn)多組分檢測腫瘤標(biāo)志物microRNA。顯著提高相關(guān)腫瘤診斷的準(zhǔn)確度。核酸染料TOTO-1本身在溶液中幾乎不發(fā)出熒光信號，但當(dāng)它嵌入到雙鏈核酸骨架中時，其熒光信號顯著提高約1000倍。其發(fā)射光譜

10、與Cy3，Cy3.5，Cy5的激發(fā)光譜重疊，可以產(chǎn)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)。miRNA-155，miRNA-182，miRNA-197作為肺癌發(fā)病早期的標(biāo)志物，在血漿中同時診斷出三種microRNA的存在，可以顯著提高疾病診斷的準(zhǔn)確度，為臨床上疾病的早期診斷提供有效途徑。因此多組分檢測腫瘤標(biāo)志物microRNA在生物醫(yī)學(xué)和臨床中具有廣闊的應(yīng)用前景。
　　5.金納米粒子比色法檢測甲型流感病毒H3N2
　　金納米粒子表面功能化修飾

11、抗血凝素單克隆抗體(mAb)，得到mAb-AuNPs探針。mAb-AuNPs探針通過抗血凝素單克隆抗體特異性識別甲型流感病毒囊膜表面富含的血凝素，從而得到探針/病毒組裝體。該探針/病毒組裝體上的金納米粒子相鄰很近，容易產(chǎn)生等離子共振耦合(SPR)效應(yīng)，在紫外可見光譜上表現(xiàn)為金納米粒子的最大吸收峰發(fā)生紅移，裸眼可見組裝體的溶液由紅色變?yōu)樗{(lán)色。同時，利用透射電子顯微鏡(TEM)技術(shù)和動態(tài)光散射(DLS)技術(shù)對探針/病毒組裝體進(jìn)行表征。在最佳