1、禽呼腸孤病毒(Avian reovirus，ARV)是呼腸孤病毒科，正呼腸孤病毒屬的成員之一。ARV在臨床上主要引起雞的關(guān)節(jié)炎/腱鞘炎。其造成患雞生長抑制、免疫功能降低、繼發(fā)感染增加等，給養(yǎng)雞業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。ARV共編碼15個蛋白，其中σ B蛋白是由S3基因編碼，是病毒的外殼蛋白之一，具有提高感染細胞的能力，并在病毒的致病機理上起著一定的作用。本試驗利用基因克隆技術(shù)體外表達σB蛋白并應(yīng)用表達的融合蛋白作為抗原建立ELISA檢測技術(shù)

2、。 根據(jù)GenBank中已發(fā)表的ARVσB序列，設(shè)計合成了一對特異性引物，對ARV 99G株的S3基因進行PCR擴增，擴增一段1100bp的基因片斷，然后克隆到表達載體pGEX-6p-1中。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達宿主菌，經(jīng)終濃度為1 mmol/L的1PTG誘導(dǎo)，高效表達了σB蛋白。經(jīng)Western-blot檢測表明，表達的融合蛋白能夠被ARV的陽性血清所識別，具有良好的抗原性。 用純化后的原核表達的ARVσB蛋白作為診斷抗

3、原，建立了檢測ARV抗體的間接ELISA方法，并對ELISA的反應(yīng)條件進行了探索，確定了抗原的最適包被濃度為5μg/mL，檢測血清稀釋液為100倍稀釋，血清與抗原反應(yīng)最佳反應(yīng)時間為1小時，酶標(biāo)二抗最佳作用時間為1小時，底物的最佳顯色時間為15分鐘。批內(nèi)重復(fù)試驗，變異系數(shù)小于10％；批間重復(fù)試驗，變異系數(shù)小于15％，說明具有很好的重復(fù)性。用此方法檢測包被的抗原不與NDV,AI，IBDV等陽性血清發(fā)生交叉反應(yīng)，表明建立的ELISA診斷方法，