1、全世界每年會產(chǎn)生大約2000億噸的農(nóng)業(yè)廢棄物，是自然界最廣泛的木質纖維素來源之一，包括農(nóng)作物秸稈、稻殼、甘蔗渣、玉米芯等。木質纖維素主要包括纖維素、半纖維素和木質素，木聚糖是半纖維素中最豐富的一類。目前，對于半纖維素酶的生物化學和分子生物學研究也主要集中在木聚糖降解酶。木聚糖酶是水解木聚糖為木糖的一類降解酶，由于其可降解木聚糖中的β-1，4糖苷鍵，既可降低木聚糖的粘性和抗營養(yǎng)性，又可產(chǎn)生具有保健和調節(jié)胃腸功能的低聚木糖，已廣泛應用于食品

2、、飼料、醫(yī)藥、造紙、紡織等行業(yè)。木聚糖結構的復雜性決定了其降解需要多種木聚糖酶的協(xié)同作用，包括水解主鏈的內切木聚糖酶、木糖苷酶以及水解側鏈的一些酯酶等。由于天然木質纖維素底物的復雜性，這些木聚糖降解酶系之間如何通過協(xié)同作用實現(xiàn)木聚糖的完全水解，其中的機理目前尚不清楚。
　　實驗室從高溫堆肥樣品中篩選得到一株高效纖維素降解真菌A.fumigatus Z5，以木聚糖為唯一碳源進行誘導發(fā)酵，通過RT-PCR、質譜分析等獲得了幾個主要的木

3、聚糖降解相關基因，包括4個內切木聚糖酶基因(Y699_04481，06333，07611，09486)，2個木聚糖苷酶基因(Y699_04570，05610)和1個乙酰木聚糖酯酶基因(Y699_05457)。本研究旨在實現(xiàn)這些木聚糖酶基因在黑曲霉AB1.13和畢赤酵母X33中的高效異源表達，同時對Afumigatus Z5中不同內切木聚糖酶和乙酰木聚糖酯酶在木聚糖降解中的協(xié)同作用進行研究，主要研究結果如下:
　　(1)對木聚糖酶基

4、因絲狀真菌表達系統(tǒng)構建過程中表達載體的構建、原生質體的制備以及轉化效率的提高進行了初步探索，獲得了黑曲霉原生質體的制備條件:菌絲體培養(yǎng)24 h，使用復配酶(蝸牛酶(100 mg/mL)+溶壁酶(100U/mL))酶解2～2.5 h。
　　(2)在畢赤酵母X33內成功地表達了來源于A.fumigatus Z5的一個GH10家族的β-1，4-內切木聚糖酶基因Y699_09486和一個具有碳水化合物結合結構域序列(cbm_1)的乙酰木聚

5、糖酯酶基因Y699_05457，對應的表達蛋白分別命名為Xyn10C和AXE1。Xyn10C轉化子發(fā)酵液酶活為83.08IU/mL，最適反應條件為70℃，pH5.0-6.0，60℃處理1h后酶活仍保持在95％以上。乙酰木聚糖酯酶AXE1轉化子發(fā)酵液酶活達到84.76IU/mL，最適反應條件為55-60℃，pH7.0-7.5，60℃處理1h后酶活保持在70％以上。
　　(3)將來源于A.fumigatus Z5的一個GH10家族的多

6、結構域內切木聚糖酶基因Y699_04481的cbm_1序列及其多絲氨酸連接序列(linker)連接在另一個GH10家族的單結構域β-1，4-內切木聚糖酶基因Y699_06333（對應的異源表達蛋白為Xyn10B）的C端，并在畢赤酵母X33內成功地進行了融合表達。比較了Xyn10B和融合蛋白Xyn10BaLC的酶學性質差異，同時對Xyn10BaLC的CBM功能進行測定。結果表明，CBM的存在不會影響Xyn10B的酶學性質，但是Xyn10B

7、aLC對燕麥木聚糖的催化效率(Kcat/Km)明顯降低，由Xyn10B的22.42 s-1 mg-1 ml-1降低至4.57 s-1mg-1 ml-1。
　　(4)研究了不同的內切木聚糖酶Xyn10C、Xyn10B和Xyn10BaLC對水洗玉米芯粉末(the washed corncob powder，WCCP)以及經(jīng)高溫高壓處理的WCCP的降解效果。結果發(fā)現(xiàn)，同屬于GH10家族的單結構域內切木聚糖酶Xyn10C和Xyn10B，對

8、于水洗玉米芯粉末(WCCP)幾乎無降解產(chǎn)還原糖能力，而帶有CBM的Xyn10BaLC則能夠降解WCCP產(chǎn)還原糖;對于經(jīng)高溫高壓處理后的WCCP，Xyn10BaLC降解產(chǎn)還原糖量增加，Xyn10C和Xyn10B也表現(xiàn)出了降解產(chǎn)還原糖能力，且Xyn10B較Xyn10C能夠產(chǎn)生更多的還原糖。從上述降解效果來看，CBM的存在使得內切木聚糖酶具備了降解天然不可溶木聚糖底物的能力，而底物的預處理會破壞不可溶木聚糖底物的結構，從而使不攜帶CBM的內切

9、木聚糖酶表現(xiàn)出降解能力，由此推測，同屬于GH10家族且都為單結構域酶的內切木聚糖酶Xyn10C和Xyn10B，在催化效率上會存在有不同的差異，這可能是燕麥木聚糖誘導的A.fumigatus Z5中Xyn10C和Xyn10B對應的基因都有高轉錄但是質譜分析卻檢測不到Xyn10C的原因。
　　(5)研究了不同的內切木聚糖酶Xyn10C、Xyn10B和Xyn10BaLC和乙酰木聚糖酯酶AXE1對水洗玉米芯粉末(WCCP)的協(xié)同降解效果，

10、結果只有Xyn10BaLC和AXE1表現(xiàn)出了對WCCP的協(xié)同效應。這可能是由于Xyn10BaLC和AXE1兩個酶均有CBM_1的存在，從而會引導它們趨向玉米芯中同一區(qū)域的木聚糖底物，因此表現(xiàn)出協(xié)同降解效果，即存在“協(xié)同效應區(qū)域化”。這一結果說明，對于復雜的天然固體木聚糖底物，CBM的存在，除了在內切木聚糖酶降解不可溶木聚糖底物過程中有很重要的作用，在內切木聚糖酶和乙酰木聚糖酯酶的協(xié)同作用中同樣占有至關重要的地位。
　　(6)研究了

11、玉米芯水洗程度及機械粉碎程度對于木聚糖酶降解效果的影響。分別以水洗玉米芯粉末(WCCP)和未水洗玉米芯粉末以及不同顆粒大小的玉米芯作底物，結果發(fā)現(xiàn)，類似于經(jīng)高溫高壓預處理的玉米芯，內切木聚糖酶Xyn10B、Xyn10BaLC、Xyn10C均能夠降解未水洗的玉米芯粉末產(chǎn)還原糖，但是Xyn10BaLC與AXE1則不再表現(xiàn)出協(xié)同效應;此外，無論是水洗還是未水洗，玉米芯顆粒越小，酶解產(chǎn)生的還原糖總量越多。Xyn10B、Xyn10C能夠降解未水洗

12、的玉米芯產(chǎn)還原糖，可能的原因是未水洗的玉米芯表面有足夠多的可溶性的、易接觸的木聚糖，這些木聚糖底物可被Xyn10B、Xyn10C直接作用，因此表現(xiàn)出了降解能力;同樣的，Xyn10BaLC的催化中心也會作用于這些可溶性的、易接觸的木聚糖，這樣就降低了Xyn10BaLC和AXE1通過CBM_1與纖維素的結合對同一特定區(qū)域木聚糖底物的導向性，因此協(xié)同效率降低。不同的內切木聚糖酶通過作用于玉米芯不同區(qū)域的木聚糖共同發(fā)揮水解作用，可能是A.fum