1、檸檬酸是一種廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品和化工行業(yè)中的重要有機(jī)酸。黑曲霉（Aspergillus niger）是檸檬酸發(fā)酵工業(yè)的主要菌種，作為一種常見的絲狀真菌，在深層發(fā)酵過(guò)程中，菌絲體的形態(tài)對(duì)檸檬酸的合成代謝有重要的影響。在工業(yè)生產(chǎn)中，可以通過(guò)調(diào)控形態(tài)基因的表達(dá)，對(duì)菌絲體的形態(tài)進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)而提高檸檬酸的產(chǎn)量和產(chǎn)率。本文主要研究黑曲霉的幾丁質(zhì)合成酶基因chsC的調(diào)控在優(yōu)化發(fā)酵形態(tài)和檸檬酸產(chǎn)量中的應(yīng)用。
　　本文選擇干擾載體pJL4

2、3-RNAi作為chsC基因沉默的質(zhì)粒載體。首先將NcoI酶切得到的chsC基因片段與質(zhì)粒pJL43-RNAi連接，構(gòu)建干擾載體pchsC-RNAi.為提高干擾載體的轉(zhuǎn)化率，對(duì)原生質(zhì)體制備、再生和轉(zhuǎn)化的條件進(jìn)行了優(yōu)化。優(yōu)化的結(jié)果表明:在36.5℃培養(yǎng)16h的幼嫩菌絲最利于原生質(zhì)體釋放;最優(yōu)的酶組合是5 mg/mL的溶菌酶，10 mg/mL的蝸牛酶和10 mg/mL的纖維素酶組成的混合酶系;在酶解溫度為30℃，以100 r/min酶解3h

3、可使原生質(zhì)體的最大產(chǎn)量達(dá)到5.11×106/mL;最優(yōu)的再生培養(yǎng)基為完全培養(yǎng)基，可以使再生率達(dá)到36.97％。
　　然后通過(guò)聚乙二醇(PEG)的介導(dǎo)將干擾載體pchsC-RNAi導(dǎo)入黑曲霉原生質(zhì)體中，篩選得到7株轉(zhuǎn)化菌。通過(guò)反轉(zhuǎn)錄PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化株的chsC基因發(fā)生不同程度的沉默;同時(shí)細(xì)胞壁的幾丁質(zhì)含量也與chsC基因的表達(dá)量呈正相關(guān)，RNAi的效果越顯著，chsC基因的表達(dá)量越低，相應(yīng)的細(xì)胞壁幾丁質(zhì)含量也

4、越低。
　　轉(zhuǎn)化菌株的檸檬酸產(chǎn)量與原始菌株相比均有所提高，其中chsC-3和chsC-5的產(chǎn)酸量提高尤為顯著，分別提高了42.57％和36.73％。而干擾效果較明顯的chsC-7的產(chǎn)酸增幅反而不明顯，僅比原始菌株增長(zhǎng)0.37％，由此推斷，chsC的表達(dá)量維持在一定水平對(duì)檸檬酸的積累有重要作用。通過(guò)顯微鏡觀察深層發(fā)酵的菌絲體形態(tài)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化菌株的菌絲分支頻率降低，菌絲分支縮短，離散菌絲減少，與原始菌株相比，發(fā)酵液的粘度降低，進(jìn)而提高了

5、物質(zhì)和氧氣在發(fā)酵液中的傳遞效率，更有利于檸檬酸的積累。
　　通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)法對(duì)高產(chǎn)菌株chsC-3在搖瓶水平的裝液量、接種量、轉(zhuǎn)速和培養(yǎng)溫度等因素進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化的結(jié)果是:裝液量為500 mL三角瓶裝60 mL培養(yǎng)基，接種量為5×104/mL，轉(zhuǎn)速為300 r/min，培養(yǎng)溫度為37℃。以優(yōu)化得到的最佳培養(yǎng)條件分別對(duì)CK和chsC-3菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，檸檬酸產(chǎn)量較優(yōu)化前均有所提高，發(fā)酵至72 h的產(chǎn)酸分別提高了7.32％和21.74