1、　　本文以目前重要的農(nóng)業(yè)害蟲——甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)為研究對(duì)象，根據(jù)已克隆的甜菜夜蛾幾丁質(zhì)合成酶全長(zhǎng)序列，選擇其中保守的催化域片段進(jìn)行克隆表達(dá)。首先根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)-對(duì)特異性引物，引物序列如下：up--TGTGGATCCCACAGTGACGATGATTCTCAG(下劃線部分為BamHI酶切位點(diǎn))，Down--TGCAAGCTTTTGATACCACACCATAGGGC(下劃線部分為HindⅢ酶切位點(diǎn)).以實(shí)驗(yàn)室存有

2、的克隆到PMD-18T載體上的甜菜夜蛾幾丁質(zhì)合成酶催化域片斷(PMD-SeCHS)為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將得到的目的大小的片段進(jìn)行割膠回收，然后進(jìn)行BamHI和HindⅢ雙酶切，將得到的帶有粘性末端的片段與經(jīng)過BamHI和HindⅢ雙酶切的pQE30表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行體外連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌TG1中，篩選菌，提質(zhì)粒，酶切鑒定后，將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌M15中測(cè)序鑒定。測(cè)序正確的菌液保存，并用IPTG誘導(dǎo)使其表達(dá)。結(jié)果表明甜菜夜蛾幾丁質(zhì)合成酶片段基因

3、已成功表達(dá)。在體外表達(dá)了甜菜夜蛾幾丁質(zhì)合成酶催化域片段的基礎(chǔ)上，還根據(jù)pQE30載體本身帶有6-His標(biāo)簽，它能將目的蛋白與6個(gè)組氨酸進(jìn)行融合表達(dá)，而Ni-NTA(鎳一次氨基三乙酸)樹脂對(duì)含有六個(gè)連續(xù)的組氨酸殘基的親和標(biāo)簽-六組氨酸標(biāo)簽(6-Histag)的蛋白的高度選擇性，將目的蛋白進(jìn)行純化，結(jié)果目的蛋白的純度增加了，可還是有少量的非目的帶的出現(xiàn)。但是足以證明了所表達(dá)的目的蛋白含有6-His標(biāo)簽，而且可以用來進(jìn)行酶的活性等的研究。本論