1、中華鱉屬于古老的次生水生爬行動物，作為變溫羊膜腔動物向恒溫動物羊膜腔進化的聯結點，不僅在生命科學研究、野生資源保護等方面具有重要的科研價值;而且中華鱉具有較高的食用和藥用價值，已成為我國及東南亞某些地區(qū)的主要特種水產養(yǎng)殖品種之一。然而，由于品種退化、病害嚴重以及基礎研究薄弱等問題，嚴重影響中華鱉研究和養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。本研究通過對中華鱉免疫相關基因的克隆和功能分析，旨在探明中華鱉天然免疫應答、應激反應的機制，為深入開展中華鱉免疫學、系

2、統(tǒng)發(fā)育以及病原與機體互作研究等奠定了良好的基礎。
　　 1.中華鱉tMyD88全長cDNA克隆及其組織表達差異分析
　　 MyD88是啟動先天免疫的主要接頭分子之一，本試驗首次獲得爬行動物屬的中華鱉MyD88(tMyD88)全長cDNA。經序列分析，全長tMyD88 cDNA ORF為894-bp，編碼297個氨基酸，N-端和C-端分別具有典型的DD結構域(death domain，DD)和保守的TIR結構域(Toll/

3、IL-1R domain)。熒光定量RT-PCR檢測中華鱉經嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)攻毒后不同臟器中tMyD88 mRNA相對轉錄水平由高到低為，脾臟＞血液＞肺臟＞肝臟＞腎臟＞小腸＞心臟＞肌肉。RAW264.7細胞經pcDNA-tMyD88轉染后，NF-κB活性顯著高于對照組(673.8 vs410.7，P＜0.05)，轉染細胞上清液中IL-1β和TNF-α含量顯著高于對照組(P＜0.01)。結果表明，獲

4、得的中華鱉tMyD88全長cDNA分子具有與哺乳動物類似的生物學活性，可能在中華鱉抗感染免疫中具有重要的作用。
　　 2.中華鱉熱休克蛋白基因tHsc70、tGRP78和tHsp72鑒定及熱應激對其表達的影響
　　 Hsp70s(70kDa heat shock proteins)作為分子伴侶，不僅參與機體的蛋白質折疊、運輸，而且可能介導機體免疫。本試驗克隆和鑒定了中華鱉熱休克蛋白基因tHsc70、tGRP78和tHsp

5、72。tHsc70全長cDNA ORF為1941-bp，編碼647個氨基酸，與脊椎動物Hsc70(heat shock cognate protein70)分子在核苷酸和氨基酸同源性分別在80-87.7％和95.5-99.5％;tGRP78 cDNA全長ORF為1980-bp，編碼660個氨基酸，與脊椎動物的GRP78(glucose regulated protein78)分子在核苷酸和氨基酸同源性分別在79.3-80.3％和92.3

6、-94％;tHsp72全長cDNA ORF為1908-bp，編碼636個氨基酸，與脊椎動物的Hsp72(inducible heat shock protein70)分子在核苷酸和氨基酸同源性分別在72-76.5％和83.6-89.1％。三個中華鱉熱休克蛋白70分子均具有ATPase結合結構域、底物結合結構域、ATP/GTP結合位點基序(AEAYLGRKK)、Hsp70s家族的三個特征性的序列標簽(IDLGTTYS，IFDLGGGTFD

7、VSIL，IVLVGGSTRIPKIQ)以及胞質(EEVD)/內質網(KDEL)一致性序列。Western-blotting分析表明，原核表達純化的tHsc70和tHsp72個熱休克蛋白可與特異性的單/多克隆抗體反應。分子進化分析表明，三個中華鱉熱休克蛋白70分子與美洲鱷(Alligator mississippiensis)和禽類(Gallus gallus)在同一群內，具有較近的親緣關系。中華鱉熱激(40℃)后，與對照組(25℃)相

8、比，四個組織中的tHsc70、tGRP78和tHsp72的mRNA轉錄水平呈現不同程度的變化。中華鱉在熱激1-4hrs后肝臟、心臟、肺臟和肌肉四個組織的tHsc70 mRNA相對轉錄水平出現0.25至20.35倍不等的上升，尤其經4 hrs熱激的中華鱉肝臟組織上升最顯著，為對照組的20.35倍(P＜0.01）。4 hrs應激組中華鱉肝臟中tGRP78 mRNA相對轉錄水平與對照組相比增加最明顯，約為1.86倍(P＜0.05）。但肝臟中t

9、Hsp72的mRNA相對轉錄水平在2hrs熱激后到達峰值，約為對照組的4.66倍（P＜0.05），隨后出現輕微下降。Westernblotting分析，中華鱉2hrs和4hrs熱激以及熱激1h、2 hrs和4hrs結合恢復1h時肝臟中tHsc70蛋白相對表達量比對照組顯著升高（P＜0.05）;熱激1h、2hrs和4hrs后肝臟中tGRP78蛋白相對表達比對照組均有顯著升高（P＜0.05）。上述結果顯示，克隆的3個分子為中華鱉熱休克蛋白7

10、0，具有較高的保守性;中華鱉熱激后，不同組織的熱休克蛋白70存在不同的表達模式，可能與細胞保護等有關。
　　 3.病原相關模式分子對中華鱉Toll樣受體及其免疫相關基因表達的影響
　　 從中華鱉脾臟中PCR擴增出tlr2(1112bp)、tlr3(565bp)、tlr4(990bp)和il-1β(159bp)的cDNA部分序列。中華鱉TLR2測序后經序列比較和結構域分析顯示，該序列與斑馬魚、雞等脊椎動物的TLR2序列同源

11、性和相似性分別為60.8-74.4％和58.6-76％，該片段包含富亮氨酸重復C端結構域(Leucine rich repeatC-terminal domain，LRRCT)(aa1-47),跨膜結構域(Transmembrane domain)(aa49-71)和TIR結構域(Toll-like/IL-1 receptor domain)(aa101-244)。中華鱉TLR3與其他脊椎動物的TLR3序列同源性和相似性分別為58-81

12、.2％和51.9-76.1％，包含跨膜結構域(aa10-32)和TIR結構域(aa62-188)。中華鱉TLR4與其他脊椎動物的相應分子的序列同源性和相似性分別為48.5-67.4％和38.2-63％，包含連續(xù)的3個LRR(aa23-46，47-70，71-94)，LRRCT(aa107-157)，跨膜結構域(aa171-193)和TIR結構域(aa206-330)。中華鱉IL-1β經BlastP分析顯示其與雞IL-1β(aa66-11

13、8)之間相似性達到60.4％，與其他脊椎動物的IL-1β序列同源性和相似性分別為49.7-61.4％和28.3-49.1％。用代表性病原相關模式分子(pathogen associated molecular pattern，PAMP)不同濃度對中華鱉外周血細胞TLRs等相關免疫分子表達影響的分析表明，中華鱉外周血細胞經4000ng/mL Zymosan刺激2 hrs后tlr2 mRNA的表達水平較高，il-1β mRNA的相對表達水平

14、隨著刺激濃度的提高而增加。Poly(I∶C)濃度在40-8000 ng/mL之間，tlr3 mRNA的相對表達水平隨著Poly(I∶C)濃度的增加出現逐漸下降的趨勢。28℃條件下，Poly(I∶C)低濃度(40ng/mL)和高濃度(4000ng/mL)刺激均能使tHsp72 mRNA轉錄水平提高;LPS刺激后，tlr4、tMyD88和il-1β mRNA的相對轉錄水平隨著濃度的提高而增加。37℃條件下，Poly(I∶C)刺激組的tlr3

15、基因表達比28℃組高1.46倍。上述結果初步表明，中華鱉Toll樣受體、MyD88、Hsp70s和il-1β對部分PAMP分子刺激具有不同程度的響應性。
　　 綜上所述，本研究首次克隆和鑒別了中華鱉tMyD88、tHsc70、tGRP78和tHsp72全長cDNA分子以及tlr2、tlr3、tlr4和il-1βcDNA部分序列，8個克隆的中華鱉分子均與禽類和爬行類的相應分子位于同一個姐妹群，而與哺乳動物、兩棲類和魚類等其他物種處