1、畢赤酵母表達系統(tǒng)是一種利用甲醇為唯一碳源和能源，高水平表達外源蛋白的真核表達系統(tǒng)。甲醇有毒，且易燃、易爆，在大規(guī)模生產過程中很不安全，而且發(fā)酵產物中易有殘留，這對畢赤酵母表達系統(tǒng)在工業(yè)、食品等方面上的應用產生一定影響。
　　源于三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子(pGAP)調控的組成型表達系統(tǒng)在表達目的蛋白時，可在同一碳源（葡萄糖、甘油、油酸或甲醇等）中連續(xù)培養(yǎng)，適宜的條件下其組成型表達也可以達到很高的水平，因此利用三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子

2、替換醇氧化酶啟動子的技術成為近年研究的熱點。
　　纖維素酶作為一種可以分解纖維素的催化劑，在食品工業(yè)、環(huán)境保護等方面應用十分廣泛。近幾年利用基因克隆及表達調控等技術獲得活性更高、適用范圍更廣的纖維素酶的基礎研究越來越深入，并且均取得顯著進展。隨著酶制劑工業(yè)的發(fā)展，一些大規(guī)模生產的微生物酶制劑多傾向采用液態(tài)酶制劑，但是液態(tài)酶不穩(wěn)定，易失活，工業(yè)上經常采用添加穩(wěn)定劑和防腐劑的方法來保持液態(tài)酶的儲存穩(wěn)定性。因此針對纖維素酶熱穩(wěn)定性差的問

3、題，篩選并優(yōu)化出液態(tài)纖維素酶酶制劑的復合穩(wěn)定劑具有非常重要的應用價值。
　　本研究利用基因克隆技術，從畢赤酵母基因組DNA中擴增GAP啟動子，替換酵母表達載體pPIC9K上的AOX啟動子，構建組成型表達載體pPIC9K-gap，先利用報告基因GUS驗證其可行性，再將內切纖維素酶eg替換報告基因GUS，構建組成型表達eg的重組載體pPIC9K-gap-eg，通過篩選最終得到在甘油誘導條件下即可分泌內切纖維素酶的組成型畢赤酵母菌株PP

4、GAP-eg4，其酶活為19 U/mL，相對于酶活為16 U/mL的誘導型畢赤酵母GS115(pPIC9K-eg)，兩者酶活相差不大。
　　對組成型畢赤酵母菌株PPGAP-eg4的產酶發(fā)酵條件進行優(yōu)化，發(fā)現當接菌量為0.5％，且在甘油為唯一碳源、添加量是0.5％的條件下連續(xù)誘導到第7天，菌株酶活最大，達到40 U/mL，是初始發(fā)酵條件下酶活力的2.2倍。
　　為了提高內切纖維素酶的儲存穩(wěn)定性，本試驗選擇添加各種穩(wěn)定劑，即在液

5、態(tài)酶制劑中添加多元醇類、糖類、金屬離子以及蛋白質等物質。結果發(fā)現，半乳糖、糊精、明膠對酶的穩(wěn)定性影響較大，因此，對半乳糖、糊精、明膠三個因素分別取三水平進行正交試驗。最終利用單因素試驗和正交試驗確定了其最佳復合穩(wěn)定劑的配比為:半乳糖4％、明膠1％、糊精8％。在該復合穩(wěn)定劑作用下，65℃保溫2h后，酶活保留率達250.67％，顯著提高了內切纖維素酶的熱穩(wěn)定性。
　　為進一步確定復合穩(wěn)定劑對液態(tài)酶制劑儲存穩(wěn)定性的影響，探討了當穩(wěn)定劑濃