1、纖維素是地球上最廉價(jià)而且最豐富的可再生資源,如果利用其作為生產(chǎn)燃料乙醇的原料將是解決世界能源緊缺的有效途徑,但是目前還沒(méi)有有效方法對(duì)其進(jìn)行充分利用。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)具有很高的糖醇轉(zhuǎn)化率,是理想的乙醇生產(chǎn)菌株,但其缺乏有效降解纖維素的酶,不能直接降解纖維素發(fā)酵產(chǎn)乙醇。
　　本研究將里氏木霉(Trichoderma reesei)內(nèi)切葡聚糖酶Ⅰ(endo-1,4-β-D-g ulcanase

2、Ⅰ,eg1)和黑曲霉(Aspergillus niger)β-葡萄糖苷酶Ⅰ(β-glucosidaseⅠ,bgl1)的編碼基因同時(shí)整合到釀酒酵母基因組中,構(gòu)建具有降解非結(jié)晶纖維發(fā)酵產(chǎn)乙醇的重組釀酒酵母。在此基礎(chǔ)上,初步研究了重組表達(dá)的里氏木霉膨脹素活性,以及膨脹素對(duì)纖維素酶降解纖維素的促進(jìn)作用。
　　本研究提取里氏木霉的RNA,通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增獲得里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶Ⅰ基因(eg1),然后與黑曲霉β-葡萄糖苷酶基因(bgl1)

3、一起克隆到表達(dá)載體pδRCMB上,構(gòu)建的重組表達(dá)載體pδRCMB-bgl1-eg1電轉(zhuǎn)化釀酒酵母細(xì)胞,二者以δDNA序列整合的方式整合到釀酒酵母W303-1A基因組中。經(jīng)G418抗性篩選、菌落PCR和剛果紅平板染色篩選獲得成功整合eg1和bgl1的重組釀酒酵母S.cerevisiae-eb。對(duì)培養(yǎng)液上清中表達(dá)的EGⅠ和BGLⅠ酶活進(jìn)行分析,運(yùn)用SDS-PAGE電泳和酶活性染色分析了重組蛋白的表達(dá)。以PASC為唯一碳源,進(jìn)行了重組釀酒酵母

4、S.cerevisiae-eb直接發(fā)酵PASC產(chǎn)乙醇的研究。
　　重組酵母S.cerevisiae-eb表達(dá)的EGⅠ酶活在120 h達(dá)到最高值0.10 IU/mL,最適溫度為60℃,最適pH為6.0。BGLⅠ酶活在144 h達(dá)到最高值4.83 IU/mL,最適pH為4.5,最適溫度為60℃。Fe3+和Co2+對(duì)EGⅠ和BGLⅠ的酶活性都有抑制作用,而Ca2+和Zn2+顯著增強(qiáng)兩種酶的活性,Mn2+和Mg2+能顯著提高BGLⅠ的酶活

5、,但抑制EGⅠ的酶活。
　　經(jīng)SDS-PAGE電泳和酶活性染色分析發(fā)現(xiàn),EGⅠ在110-160 kDa分子量范圍內(nèi)出現(xiàn)三條活性條帶,BGLⅠ在約140 kDa處出現(xiàn)活性條帶,均大于預(yù)期分子量。重組蛋白經(jīng)過(guò)去糖基化處理后,分別在約50 kDa和100 kDa出現(xiàn)表達(dá)條帶,接近兩種蛋白的預(yù)期分子量,證明重組酵母表達(dá)的EGⅠ和BGLⅠ都發(fā)生了糖基化修飾。重組酵母S.cerevisiae-eb能以5 g/L的PASC為唯一碳源進(jìn)行生長(zhǎng)和發(fā)

6、酵,發(fā)酵開(kāi)始后60 h達(dá)到生成乙醇的最高值1.2 g/L。乙醇產(chǎn)量達(dá)到理論值的42.78％。
　　本研究將里氏木霉膨脹素基因(swol)整合到釀酒酵母基因組中進(jìn)行分泌表達(dá)。重組表達(dá)的膨脹素蛋白能夠膨化濾紙,增大濾紙的透光性。用共培養(yǎng)的方法將重組釀酒酵母S.cerevisiae-eb和S.cerevisiae-swol共同降解微晶纖維素發(fā)現(xiàn),膨脹素能夠促進(jìn)EGⅠ和BGLⅠ兩個(gè)纖維素酶對(duì)纖維素的降解,對(duì)纖維素的降解起到一定的輔助作用。