15243.解纖維素熱酸菌纖維素酶在植物中的表達_第1頁
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1、碩士學位論文解纖維素熱酸茵纖維素酶在植物中的表達ExpressionsofAcidothermuscellulolyticusCellulasesinPlants作者姓名:學科、專業(yè):學號:指導(dǎo)教師:完成日期:奎塞型窒Q!墨生魚旦大連理工大學DalianUniversityofTechnology大連理工大學碩士學位論文摘要大規(guī)模生產(chǎn)低成本的纖維素水解酶為木質(zhì)纖維素的生物轉(zhuǎn)化提供了經(jīng)濟可行性。利用轉(zhuǎn)基因植物作為生物反應(yīng)器大量表達纖維素酶

2、,在生物質(zhì)能學領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價值。本研究利用解纖維素熱酸菌(Acidothermuscellulolyticus)的耐高溫內(nèi)切葡聚糖酶(E1)和外切葡聚糖酶(Guxl),構(gòu)建了九種植物表達載體,實現(xiàn)了將外源纖維素酶在煙草和水稻細胞中的表達。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將植物表達載體導(dǎo)入煙草或水稻中,通過PCR檢測和酶活性測定表明外源纖維素酶基因己成功轉(zhuǎn)化到煙草或水稻中,并獲得了具有酶活性的植株。在轉(zhuǎn)基因煙草中,定位在質(zhì)外體中的重組內(nèi)切葡聚糖酶E

3、1具有最高的酶比活性,約為游離在細胞質(zhì)中重組酶E1活性的3倍,而單獨表達外切葡聚糖酶催化結(jié)構(gòu)域的煙草酶比活性最低。轉(zhuǎn)基因水稻中同樣是定位于質(zhì)外體的重組酶E1具有最高的酶活性(143nmolMUmg。1TSPmin。1),分別約為單獨表達內(nèi)切酶催化結(jié)構(gòu)域和外切酶催化結(jié)構(gòu)域酶活性的13和16倍。對于內(nèi)切葡聚糖酶的表達來說,煙草致病抗性信號肽比煙草鈣網(wǎng)蛋白信號肽的效果更佳,同時也表明Ko圳(一CALSP序列對重組內(nèi)切葡聚糖素酶的比活性影響較小

4、。融合纖維素酶在酶活測定時沒有顯著的優(yōu)勢,分析認為不同的植物細胞定位是酶活性差異的主要原因。對于水稻中表達的纖維素酶進行酶學性質(zhì)分析顯示,重組內(nèi)切葡聚糖酶在70℃左右時具有較好的熱穩(wěn)定性,最適pH約為50,pH大于7時酶活性喪失嚴重。含有重組內(nèi)切葡聚糖酶的水稻葉片在室溫條件下貯存一個月后,酶活性損失約25%。培養(yǎng)過程中,與野生型植株相比,轉(zhuǎn)基因煙草和水稻植株均沒有顯著的表型變化,可見在植物中表達的外源耐高溫纖維素酶沒有對植物造成較為嚴重

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