1、膿毒癥(sepsis)是由各種致病微生物或其毒素引起的全身炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，是嚴重感染、重度創(chuàng)傷和燒傷、大手術和休克等臨床危重患者的嚴重并發(fā)癥之一，其進一步發(fā)展可導致膿毒性休克(septic shock)、急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)和多器官功能障礙綜合征(multiple

2、organ dysfunction syndrome，MODS)等。
　　 膿毒癥及其并發(fā)癥是危重病醫(yī)學面臨的棘手問題，一直是導致重癥監(jiān)護病房(intensive care unit，ICU)患者高發(fā)病率和高死亡率的主要原因，其中SIRS死亡率接近26％，膿毒癥休克的死亡率更可高達82％。當前，膿毒癥存在著患病率高、病死率高、治療費用高的三高現(xiàn)象，已經(jīng)構成對人類健康的嚴重威脅和經(jīng)濟發(fā)展的巨大負擔。據(jù)統(tǒng)計，膿毒癥的患病率約為總人口

3、的0.3％，我國每年發(fā)生的總病例數(shù)超過400萬例，并以每年約1.5％的比例增長，病死率平均為40％；美國每年約有75萬人發(fā)生膿毒癥休克，病死率可達50％以上。
　　 近年來，膿毒癥及發(fā)病機制的研究已成為十分活躍的前沿領域之一，日益受到國內、外廣大臨床醫(yī)生和科研人員的高度關注。目前，在膿毒癥發(fā)病機制與臨床意義的研究上都取得了一定進展，但膿毒癥、MODS治療的Ⅲ期臨床試驗并未能取得預期的效果。盡管付出了巨大的努力，但由于膿毒癥發(fā)病機

4、制復雜，臨床治療困難，近40年來，其臨床療效和預后一直沒有得到實質性地改善，已經(jīng)構成對人類健康的嚴重威脅和經(jīng)濟社會的巨大負擔。在生命科學得到巨大發(fā)展的今天，膿毒癥仍然如此猖獗，無疑引起我們的高度重視。這些事實表明膿毒癥的根本發(fā)病環(huán)節(jié)及作用機制尚有待深入研究，新的干預途徑更值得探索。
　　 流行病學分析顯示，在細菌感染所致的膿毒癥中，有45～60％為革蘭陰性菌感染。內毒素是革蘭陰性菌細胞壁外膜的結構成分之一，其化學本質為脂多糖(l

5、ipopolysaccharide，LPS)，是引起膿毒癥的主要因素。LPS進入血液循環(huán)后，可刺激單核巨噬細胞、內皮細胞等主要的炎癥細胞，誘導其結構和功能發(fā)生改變，并導致相應的合成和分泌功能發(fā)生變化，導致細胞表面一些與炎癥相關的分子表達增高或暴露其相應的活性結構部位。與正常的細胞相比，受刺激的細胞表面存在著數(shù)量和/或結構上具有差異的分子，這些分子可能與內毒素休克的發(fā)生發(fā)展密切相關，可作為內毒素休克治療新的候選靶點。這些細胞表面差異分子有

6、可能是炎癥級聯(lián)反應時某些重要炎癥介質的結合位點，尋找其特異性結合肽，則有可能通過競爭性抑制相應炎癥介質與效應細胞的結合，進而中和或阻斷這些炎癥介質的生物學效應，如進一步激活靶細胞釋放細胞因子、介導細胞黏附等，從而達到阻斷或減輕全身性炎癥反應發(fā)生的目的。這種對特定細胞具有靶向治療作用的生物活性肽的特點是更為高效和副作用小。其關鍵步驟為發(fā)現(xiàn)LPS刺激單核巨噬細胞或內皮細胞的特異性高親和力結合肽。
　　 噬菌體展示技術是20世紀90年

7、代發(fā)展起來并得到廣泛應用的新技術，其原理是將外源多肽或蛋白與噬菌體的一種衣殼蛋白融合表達，融合蛋白將展示在噬菌體的表面，而編碼這個融合子的DNA則位于該噬菌體內。噬菌體展示技術的一個最基本的特征是將表現(xiàn)型和基因型有效聯(lián)系起來，即噬菌體表面的特定表現(xiàn)型與噬菌體顆粒中的基因型信息相對應，如需得到某個特定的表現(xiàn)型，只需在噬菌體基因組中插入該表現(xiàn)型的相關基因即可。噬菌體展示技術使大量隨機多肽與其DNA編碼序列之間建立了直接聯(lián)系，使各種靶分子(抗

8、體、酶、細胞表面受體等)的多肽配體通過一種被稱為淘選(panning)的體外選擇程序得以快速鑒定。最簡單的淘選程序，是將噬菌體展示肽庫與包被有靶分子的平板(或磁珠)共溫育，先洗去未結合的噬菌體，然后洗脫特異性結合的噬菌體。將被洗脫的噬菌體進行擴增，然后再進行下一輪的結合/擴增循環(huán)，以富集那些可結合序列。經(jīng)3～4輪淘選后，通過DNA測序對每個可結合克隆進行定性。展示在噬菌體表面的隨機肽庫可應用于許多方面的研究，包括繪制抗原表位圖譜、研究蛋

9、白質-蛋白質相互作用和鑒定非肽配體的肽模擬物等。
　　 Ph.D.-C7C噬菌體展示肽庫是將隨機七肽融合到M13噬菌體次要衣殼蛋白(pⅢ)上而構建成的一個組合文庫。所展示的隨機多肽兩側各有一個半胱氨酸(Cys)。在非還原條件下，這兩個半胱氨酸自發(fā)地形成一個二硫鍵，使展示的多肽環(huán)化。受限于二硫鍵環(huán)內的7肽庫已被證實能識別抗原表位結構、D-氨基酸靶分子的鏡像配基及開發(fā)以多肽為基礎的治療藥物等。
　　 近年發(fā)展起來的體內噬菌體

10、展示技術，是尋找組織、器官特異性結合多肽的有效手段。此方法可在受體分子尚不清楚的情況下，以受體天然存在的環(huán)境--組織器官為配基，利用噬菌體短肽的抗原特異性，尋找未知的靶分子，確定其結構域。本研究采用體內噬菌體展示技術，對內毒素休克小鼠肝臟血管內皮細胞進行了篩選，尋找其表面分子的特異性結合肽，以期為內毒素休克的治療及其發(fā)生發(fā)展機制的研究提供新的思路與線索。
　　 我們選取4只BALB/c小鼠，雄性，8周齡，以35 mg/kg的劑量

11、腹腔注射LPS，頸動脈插管后，監(jiān)測小鼠動脈血壓，復制內毒素休克模型。我們對內毒素休克狀態(tài)下小鼠的肝臟血管內皮細胞進行了四輪篩選，然后又用正常小鼠做了一次差減篩選，即得到了與休克小鼠肝臟血管特異性結合，而與正常小鼠肝血管不結合的噬菌體文庫。我們對所篩得的噬菌體克隆進行了一個初步的體內回輸實驗，驗證其在內毒素休克小鼠體內的靶向情況，一共驗證了20個噬菌體克隆，發(fā)現(xiàn)有15個克隆為陽性克隆(單位重量肝臟中回輸?shù)降氖删w是對照器官的三倍以上)。隨

12、機挑取噬菌體克隆，經(jīng)過PCR擴增出其目的片段以后，進行DNA測序，并根據(jù)插入序列推導出外源七肽的氨基酸序列，一共得到正確的有插入片段的序列1，063條。
　　 這些七肽序列中包含大量的三肽殘基，其中一些三肽基序作為生化識別單元(biochemical recognition units)中的配基，往往是某些功能蛋白的模擬表位(mimotooe)，因此尋找這些模擬表位及其對應的功能蛋白具有重大意義。我們采用完全重排七肽的方法，應用

13、混排(洗牌)算法(shuffling algorithm)，統(tǒng)計大量噬菌體展示七肽中某特定三肽出現(xiàn)的次數(shù)(豐度)及其顯著性，結果顯示，1，063個陽性噬菌體展示七肽中包括有3，390個不同的三肽殘基，其中豐度具有顯著性意義的三肽有200個。然后，利用Clustal W軟件對包含豐度具有顯著性或豐度較高的三肽基序的七肽進行多序列比對(multiple sequence alignment)分析，并結合氨基酸的性質，在這些七肽中尋找特征性短

14、肽基序(模擬表位)，共得到62個特征性短肽基序；通過在線BLAST服務，將這些短肽基序同鼠蛋白質序列數(shù)據(jù)庫(SWISS-PROT)進行相似性比對分析，獲得所有已知的包含這些特征性短肽的鼠類蛋白；進一步應用SignalP和TMHMM預測軟件篩選其中的分泌蛋白和跨膜蛋白，從中獲得目的功能蛋白。
　　 我們對出現(xiàn)次數(shù)最多的噬菌體展示七肽(LTTWAPA)進行了體內導向效果鑒定和免疫組化染色分析。體內導向效果鑒定實驗顯示，呈現(xiàn)LTTWA

15、PA的噬菌體在休克小鼠單位重量肝臟中的回收量是8.0×108/g，分別是腎臟的40倍(2.0×107/g)，腦組織的80倍(1.0×107/g)。而在正常小鼠的驗證中，目標噬菌體在單位重量肝臟中的回收量與腦組織和腎臟沒有明顯差異，均遠低于在休克小鼠肝臟中的回收量。對照組的空噬菌體在休克小鼠各臟器的的回收量是基本保持一致的。初步認為，我們篩選到的該噬菌體克隆在內毒素休克小鼠肝臟有很好的導向效果。
　　 免疫組化染色顯示，表達LTT

16、WAPA序列的噬菌體定位于內毒素休克小鼠肝臟的血管內皮細胞，而在休克小鼠的腦組織和腎臟以及正常小鼠的肝、腎、腦均未見明顯染色。同時，我們設立了同等量的空噬菌體作為對照，對照組的空噬菌體在休克小鼠和正常小鼠的肝臟均未見染色。說明我們篩選到的該噬菌體能夠有效地靶向于內毒素休克小鼠的肝臟血管，而不結合于休克小鼠的其它臟器，也不結合于正常小鼠的各臟器。
　　 總之，本研究在靶分子未知的情況下，采用體內噬菌體展示技術，對內毒素休克小鼠肝臟

17、血管內皮細胞進行4輪篩選，并與正常小鼠做了一次差減篩選，獲得與內毒素休克小鼠肝臟血管內皮細胞特異性結合的短肽序列，應用生物信息學技術對這些短肽序列進行分析和預測，并進一步鑒定預測得到的功能蛋白和表位模擬肽的生物學活性。通過以上研究，我們得出以下幾點結論：
　　 1.成功復制了內毒素休克小鼠模型；
　　 2.運用體內噬菌體展示技術，篩選到了內毒素休克小鼠肝臟血管特異性結合肽庫。并且經(jīng)過四輪篩選，噬菌體文庫在內毒素休克小鼠肝

18、臟得到了有效富集；
　　 3.隨機挑取20個噬菌體克隆進行了體內回輸實驗驗證，有15個克隆為陽性噬菌體克??；
　　 4.通過挑斑和PCR擴增，得到了1，063條七肽序列，經(jīng)過生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)1，063條展示七肽中共包括有3，390個不同的三肽殘基，其中具有顯著性意義的三肽有200個；
　　 5.應用Clustal W軟件并結合氨基酸性質，分別對包含具有顯著性意義三肽基序的所有七肽進行多序列比對分析，獲得了62

19、個具有表位模擬肽性質和功能的特征性短肽；
　　 6.應用BLASTP程序與鼠蛋白質數(shù)據(jù)庫進行同源性比對分析得到包含以上特征性短肽基序的蛋白2，922個，進一步利用SignalP和TMHMM預測軟件獲得分泌蛋白和跨膜蛋白，其中分泌蛋白98條，跨膜蛋白226條，既為分泌蛋白又為跨膜蛋白的序列20條；
　　 7.對出現(xiàn)次數(shù)最多的噬菌體克隆(LTTWAPA)進行了體內回輸實驗驗證，體內回輸實驗初步證實該噬菌體克隆能有效靶向于內毒