1、肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，發(fā)病率呈不斷上升趨勢。目前，它的治療主要以手術(shù)、化療和放療為主，患者5年生存率不到50﹪，且不能切除腫瘤的患者5年生存率為0。因而迫切需要有創(chuàng)新性、突破性的早期治療手段，而腫瘤基因療法為此提供了一條新思路。其中，以納米載體作為基因治療的運載體，已逐漸成為此領(lǐng)域中的一個十分重要的研究方向。然而，無論是離體基因治療(ex-vivo)，還是體

2、內(nèi)基因治療(in-vivo)，都必須解決如何使納米載體攜帶的目的基因能夠靶向轉(zhuǎn)移并高效表達的問題。迄今，肝癌基因治療的效果仍然不能令人滿意，缺乏可利用的針對肝癌細胞的高靶向性分子是其重要的障礙。為此，篩選肝癌細胞特異性靶向分子，并將其與納米基因載體結(jié)合，已成為提高納米基因載體肝癌治療效果的關(guān)鍵問題之一。 為實現(xiàn)納米基因載體的腫瘤主動靶向治療，目前主要有兩種載體表面靶向修飾的策略可被利用。第一種策略是將能與腫瘤細胞表面高表達受體結(jié)

3、合的小分子化合物(如葉酸)作為納米載體的靶向性分子。第二種策略是通過特異性腫瘤細胞單克隆抗體完成納米載體與細胞的定向結(jié)合。近年來，用能與腫瘤組織高親和力結(jié)合的小分子肽(如RGD)作為靶分子進行藥物靶向轉(zhuǎn)運的成功經(jīng)驗，已讓我們看到了在此基礎(chǔ)上發(fā)展第三種納米載體靶向腫瘤策略的希望。 為此，本文首先通過噬菌體展示肽庫，篩選獲得一批能夠與肝癌細胞特異性結(jié)合的短肽，并鑒定它們與肝癌細胞的結(jié)合特異性。我們的研究為進一步研制用于治療肝癌的靶向

4、納米基因載體奠定了初步的實驗基礎(chǔ)。 第一章人肝癌細胞特異性結(jié)合短肽的篩選 目的：通過噬菌體展示肽庫，篩選人肝癌細胞結(jié)合短肽，驗證它與肝癌細胞特異性結(jié)合的能力。 方法： (1)以人正常肝細胞(L-02)為陰性消減細胞，人肝癌細胞(HepG2)為篩選靶細胞，對噬菌體隨機七肽庫(PHD-7<'TM>)進行全細胞消減篩選。 (2)體外篩選4輪后，隨機挑取50個陽性噬菌體克隆進行序列測定，并進行短肽序列的同

5、源性分析。 (3)以EIJISA法鑒定噬菌體與HepG2細胞的結(jié)合活性，排除假陽性或無差異結(jié)合的噬菌體。根據(jù)序列分析及ELISA鑒定的結(jié)果，選擇其中一個具有較高親合力的噬菌體克隆進行結(jié)合特異性的分析。 結(jié)果： (1)經(jīng)過4輪體外篩選，可見噬菌體在靶細胞HepG2上出現(xiàn)明顯富集。結(jié)果表明，回收噬菌體的滴度由第一輪的0.6x10<'4>pfu增加到第四輪的5.856x10<'6>pfu，增加了976倍；同時，回收率也

6、顯著提高，由第一輪的0.3×10<'-7>增至第四輪的292.8×10<'-7>。相對而言，對照細胞L-02的回收率則由第一輪的3.48×10<'-7>降至第四輪的0.61×10<'-7>。 (2)以藍白斑實驗隨機挑取50個攜帶噬菌體的大腸桿菌克隆，經(jīng)測序得到各噬菌體單克隆的多肽插入序列(S1～S50)，其中，編號為S1的克隆重復(fù)14次，S4重復(fù)13次，S13重復(fù)8次，S8重復(fù)3次，S9、S14各重復(fù)2次，S20出現(xiàn)1次，因而最

7、終產(chǎn)生7條核苷酸序列，分別為S1、S4、S13、S8、S9、S14、S20。根據(jù)氨基酸密碼子，將上述插入序列翻譯成氨基酸，即為噬菌體展示短肽+HCBP(Hepatoma，Cells Binding Peptide)。分別被命名為HCBP1、HCBP4、HCBP13、HCBP8、HCBP9、HCBP14，HCBP20。經(jīng)BLAST分析發(fā)現(xiàn)，在已知蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中未發(fā)現(xiàn)與這些短肽序列完全一致或具有較好同源性的蛋白質(zhì)分子。 (3)酶聯(lián)免

8、疫分析(ELISA)鑒定顯示，上述幾個陽性克隆在HepG2細胞和L-02細胞上有差異性結(jié)合，其中S1噬菌體克隆對兩種細胞的結(jié)合差異性最大。結(jié)合測序分析，本文選擇S1噬菌體克隆做進一步鑒定。 第二章：HCBP1結(jié)合短肽特異性的鑒定 目的：分析S1噬菌體克隆及人工合成短肽HCBP1與肝癌細胞結(jié)合的特異性。 方法： (1)通過體外結(jié)合實驗、免疫細胞化學(xué)染色，鑒定S1噬菌體克隆與肝癌細胞結(jié)合的特異性；通過免疫組織

9、化學(xué)染色，鑒定S1噬菌體克隆與人肝癌組織結(jié)合的特異性。 (2)人工合成該噬菌體所呈現(xiàn)的短肽，采用競爭ELISA實驗證明合成短肽對噬菌體與靶細胞結(jié)合的競爭性抑制作用。 (3)利用免疫熒光技術(shù)觀察人工合成肽HCBP1與肝癌細胞的結(jié)合特異性。 結(jié)果： (1)體外結(jié)合實驗、免疫細胞化學(xué)染色及免疫組織化學(xué)染色均顯示，S1噬菌體克隆對肝癌細胞的結(jié)合靶向性明顯高于對照細胞，并能與肝癌組織特異性結(jié)合。 (2)競爭

10、ELISA實驗顯示，S1噬菌體克隆與HepG2細胞的結(jié)合能被其插入序列的人工合成肽HCBP2競爭抑制。 (3)免疫熒光顯色證實，F(xiàn)ITC-HCBP1能特異性地結(jié)合于肝癌細胞的胞膜及核周胞漿。 結(jié)論： (1)本實驗獲得了7個在}tepG2細胞、L-02細胞上有差異性結(jié)合的噬菌體克隆(S1、S4、S13、S8、S9、S14、S20)，并證實S1噬菌體克隆所呈現(xiàn)的七肽HCBP1能與靶細胞高親合性結(jié)合。 (2)本