1、丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(hepatitisCvirus，HCV)感染引起的一種世界性傳染病，目前全球HCV感染者近1億7千萬。HCV急性感染后約40-60％以上患者發(fā)展為慢性感染，其中部分病人可發(fā)展為肝硬化或肝癌。迄今為止，對HCV慢性感染尚無高效的特異性治療方法。 HCV屬于黃病毒家族，是單股正鏈RNA病毒，基因組全長約9.5kb，有一個大的開放閱讀框，可翻譯成一個約3000個氨基酸的多聚蛋白前體，該前體蛋白在宿主信號肽酶和

2、病毒自身蛋白酶的加工下，產(chǎn)生結(jié)構(gòu)蛋白(C，E1，E2，)和非結(jié)構(gòu)蛋白(P7，NS2，NS3，NS4A，NS4B，NS5A，NS5B等)。 HCV的包膜糖蛋白E2分布于病毒顆粒表面，可能與病毒和宿主間免疫應(yīng)答及介導(dǎo)病毒進人靶細胞等過程密切相關(guān)，因此成為預(yù)防HCV感染研究中的主要角色。E2蛋白能與肝細胞表面的多種分子結(jié)合，其中，人CD81分子(hCD81)己被公認為是HCV的重要受體。雖然CD81介導(dǎo)HCV感染的機制尚不清楚，但是體

3、外試驗表明，CD81分子是HCV感染原代肝細胞以及肝源性腫瘤細胞所必需的。因此，靶向人CD81的模擬分子對于HCV感染的治療有著應(yīng)用前景，這也是目前HCV治療藥物領(lǐng)域的一個研究熱點。 在本實驗中，我們首先分別在哺乳動物細胞中表達了HCVE2蛋白和在大腸桿菌中表達了人CD81分子大胞外環(huán)。再以hCD81單抗為配基，從噬菌體12肽庫中篩選hCD81模擬小肽，通過實驗證明能競爭抑制HCVE2和hCD81的結(jié)合。第一部分HCV包膜E2蛋

4、白和人CD81分子大胞外環(huán)的表達及HCV假病毒的構(gòu)建 用中國倉鼠卵巢細胞(CHO)分泌表達HCV包膜E2蛋白。首先根據(jù)1b基因型HCV包膜E2蛋白編碼基因的核苷酸序列設(shè)計并合成引物，以聚合酶反應(yīng)(PCR)擴增HCV包膜E2蛋白外段基因；將neo基因插入真核表達質(zhì)粒pCI-neo的內(nèi)含子基因的剪切供體與剪切受體位點之間，而將HCV包膜E2蛋白基因置于neo基因內(nèi)含子的3’端，構(gòu)建了新型的哺乳動物細胞表達質(zhì)粒載體pCIDA-neo-

5、E2。該質(zhì)粒載體利用真核啟動子高水平調(diào)控HCV包膜E2基因的表達，借助于內(nèi)含子的剪切功能篩選用的標記基因(neo)僅低水平表達。以表達質(zhì)粒pCIDA-neo-E2轉(zhuǎn)染CHO-K1細胞，因neo為G418的標志基因，以G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞克隆。將篩選的標記基因neo插入人珠蛋白內(nèi)含子中，因內(nèi)含子在轉(zhuǎn)錄出的mRNA中被切除，因而不影響目的基因的表達。有報道，與常規(guī)的雙順反子表達質(zhì)粒相比，該質(zhì)粒中的篩選基因顯著降低。用一定濃度的G418

6、篩選時，細胞能抵抗的G418濃度與細胞內(nèi)neo基因表達水平在一定范圍內(nèi)成正比，因此，通過G418篩選，只有染色體中高拷貝整合質(zhì)粒編碼的細胞才能存活，而存活的細胞則能高水平表達質(zhì)粒編碼的目的基因-HCV包膜E2蛋白。將培養(yǎng)上清進行濃縮，濃縮液進行westernblot檢測，E2抗體為山羊抗HCV包膜E2蛋白多抗，結(jié)果可見細胞裂解液中存在各種不同分子量形式的E2蛋白，最高分子量的蛋白為完全糖基化E2，而其余為部分糖基化E2。細胞培養(yǎng)上清用抗

7、E2單克隆抗體進行dotblot檢測，也能檢測到分泌在上清中的E2蛋白。 以克隆有人CD81cDNA的質(zhì)粒pMD18-hCD81為模板，PCR擴增CD81LELcDNA，插入原核表達載體pET32a，得到的重組質(zhì)粒pET32a-CD81LEL編碼硫氧還蛋白和人CD81分子融合蛋白。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，該重組菌可表達分子量約28kD的重組蛋白，與目的蛋白分子量相似，并且，重組蛋白主要以可溶性形式存在。Westernblot分析證明，融

8、合蛋白具有人CD81LEL抗原性。用Ni-NTA純化可得到純度較好的融合蛋白。通過ELISA檢測，所表達的HCVE2蛋白可以和CD81胞外環(huán)結(jié)合。 構(gòu)建HCV包膜E1-E2蛋白真核表達質(zhì)粒，與小鼠白血病病毒核心蛋白以及綠色熒光蛋白逆轉(zhuǎn)錄病毒表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞，用細胞培養(yǎng)上清感染人肝癌細胞Huh7.5，可觀察到Huh7.5細胞內(nèi)綠色熒光蛋白的表達，流式分析檢測到細胞的感染率為0.2-0.9％。 第二部分人CD81樣

9、小肽的隨機肽庫篩選與活性鑒定以抗hCD81單抗為配基，對12肽庫進行三輪篩選，把每次洗脫下來的噬菌體擴增，純化，用作下一輪的篩選。取第三輪篩選的噬菌體鋪平板，一共隨機挑取了分隔良好的32個噬菌體陽性克隆，分別擴增純化后，分別以抗CD81單抗、HCVE2為抗原做ELISA檢測，最后選取3個親和力最高的陽性克隆作DNA測序，氨基酸序列都符合隨機12肽庫的序列，查找GenBank數(shù)據(jù)庫，在一級結(jié)構(gòu)上與CD81均不具有同源性。初步可以推斷，所篩

10、選的小肽可能只是模擬hCD81的活性序列。以HCVE2蛋白包被酶標板，分析噬菌體陽性克隆對HCVE2蛋白與CD81結(jié)合的影響，結(jié)果可見，噬菌體能有效抑制HCVE2蛋白與人CD81的結(jié)合，表現(xiàn)出明顯的量效依賴關(guān)系。 小結(jié)1分別用CHO細胞和大腸桿菌成功表達了功能性HCV包膜E2蛋白和人CD81分子大胞外環(huán)，并構(gòu)建成功裝配有HCV包膜蛋白的HCV假病毒顆粒。為進一步開展抗HCV感染的小分子競爭性抑制劑、HCV受體以及HCV疫苗的研究