1、[目的]構(gòu)建噬菌體展示肽庫(kù)，篩選出大腸癌早期檢測(cè)分子標(biāo)志群，確定臨床可以使用的診斷大腸癌的分子標(biāo)志。
　　 [方法](1)構(gòu)建大腸癌噬菌體展示肽庫(kù)：收集30例上海長(zhǎng)海醫(yī)院肛腸外科手術(shù)后立即凍存的大腸癌組織標(biāo)本。用Trizol法抽提總RNA，用mRNA提取試劑盒結(jié)合poly(A)的磁珠提取mRNA，通過OrientExpression cDNA和Cloning System兩個(gè)試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄、末端平齊、片段長(zhǎng)短篩選、加接頭、雙酶

2、切、加雙臂、體外包裝等步驟，成功地構(gòu)建了大腸癌噬菌體展示肽庫(kù)。(2)大腸癌特異性的相關(guān)肽的富集：我們進(jìn)行了正反向的五輪親和篩選以富集可以和大腸癌自身抗體相結(jié)合的特異的展示肽。(3)大腸癌特異性標(biāo)志物的篩選：隨機(jī)挑選了五輪篩選后的2000個(gè)噬菌體克隆進(jìn)行ELISA初篩。96孔酶標(biāo)板用1∶10000稀釋的T7 tailer抗體包被，經(jīng)洗滌、封閉、洗滌、加噬菌體液、加血清、洗滌、加HRP耦聯(lián)的羊抗人IgG、洗滌、顯色、終止等步驟，在波長(zhǎng)450

3、m下通過酶標(biāo)儀讀取OD值。大腸癌組為陽(yáng)性、對(duì)照組為陰性的噬菌體即為有意義的、可能具有診斷價(jià)值的樣本。(4)測(cè)序和蛋白質(zhì)功能預(yù)測(cè)：通過ELISA篩選出的噬菌體克隆，測(cè)序后經(jīng)過NCBI上的BLAST序列對(duì)比找到完全一致的或者最接近的已知基因序列，從而推測(cè)我們所獲得的基因與癌癥是否相關(guān)。(5)ELISA復(fù)篩：經(jīng)測(cè)序及比對(duì)后，共20個(gè)克隆用30例大腸癌患者血清及30例對(duì)照患者血清進(jìn)行ELISA復(fù)篩。方法同ELISA初篩。(6)ELISA驗(yàn)證：經(jīng)

4、ELISA復(fù)篩后，挑選出有代表性的5個(gè)克隆，用60例大腸癌患者血清及60例對(duì)照患者血清進(jìn)行ELISA驗(yàn)證。方法同ELISA初篩。(7)免疫組化驗(yàn)證：對(duì)COX6B1進(jìn)行免疫組化驗(yàn)證，采用EnVision二步法進(jìn)行。
　　 [結(jié)果](1)構(gòu)建的大腸癌噬菌體展示肽庫(kù)的滴度為3.0×106pfu。隨機(jī)挑選20個(gè)噬菌體斑進(jìn)行PCR鑒定其重組率為60％。(2)ELISA初篩共篩選出22個(gè)有意義的噬菌體克隆，其中871號(hào)噬菌體擴(kuò)增失敗。獲得其

5、它21個(gè)克隆測(cè)序結(jié)果后，發(fā)現(xiàn)其中有2個(gè)基因測(cè)序失敗，5個(gè)為未知功能的基因，在已經(jīng)研究過的基因中有報(bào)道有11個(gè)基因與腫瘤相關(guān)。21個(gè)基因中有一組相同基因，分別為73和1048號(hào)。(3)ELISA復(fù)篩后挑選出具有代表性的5個(gè)克隆，分別為95號(hào)、149號(hào)、174號(hào)、396號(hào)及1009號(hào)。(4)ELISA驗(yàn)證可見95號(hào)、149號(hào)、174號(hào)、396號(hào)及1009號(hào)噬菌體診斷大腸癌的ROC曲線下面積分別為0.763，0.669，0.790，0.742

6、，0.796(所有P＜0.05)。其聯(lián)合檢測(cè)大腸癌的敏感度為95％(P＜0.001)，特異度為69％(P＜0.001)，其ROC曲線下面積為0.886，95％可信區(qū)間為(0.827，0.945)。(5)免疫組化結(jié)果顯示COX6B1在大腸癌組織表達(dá)顯著高于正常粘膜組織。經(jīng)統(tǒng)計(jì)兩者間有顯著性差異(P＜0.001)。
　　 [結(jié)論](1)T7噬菌體展示肽庫(kù)的構(gòu)建可以很好的展示各種小豐度的蛋白。(2)五輪親和篩選可富集表達(dá)大腸癌特異抗原