1、背景：腫瘤細(xì)胞高表達(dá)分子被作為腫瘤靶向治療的藥物靶點(diǎn)。腫瘤靶向治療有三種研究策略。第一種策略是獲得腫瘤藥物靶點(diǎn)的單克隆抗體。第二種策略是噬菌體肽庫篩選獲得與藥物靶點(diǎn)分子高親和力結(jié)合的小分子肽。第三種策略是獲得生長(zhǎng)因子片段及其衍生物，以阻斷生長(zhǎng)因子受體的功能。 胰島素受體是一種生長(zhǎng)因子受體，在肝癌細(xì)胞表面表達(dá)高于正常肝細(xì)胞，是肝癌靶向治療的侯選靶點(diǎn)分子之一。噬菌體肽庫是在一種噬菌體外殼蛋白末端連接上大量結(jié)構(gòu)各異的肽鏈。當(dāng)肽庫與胰島

2、素受體結(jié)合，只有與受體具有高親和力的多肽被篩選出來。通過提取噬菌體DNA測(cè)序獲得多肽的氨基酸殘基序列。再用多肽合成儀人工合成多肽。這種多肽可能具有肝癌等腫瘤靶向性。用噬菌體肽庫篩選腫瘤高表達(dá)分子的高親和力多肽是研究腫瘤靶向藥物的一條重要途徑。 目的：噬菌體隨機(jī)環(huán)7肽庫篩選能與胰島素受體高親和力結(jié)合的多肽，人工合成多肽作為放射性核素或腫瘤化療藥物載體，用于肝癌的放射性核素顯像診斷和肝癌的靶向治療。 方法：篩選：將大鼠肝胰島

3、素受體包被在培養(yǎng)皿上，用噬菌體環(huán)7肽庫與胰島素受體結(jié)合，收集結(jié)合在固相受體上的噬菌體。擴(kuò)增篩選獲得的噬菌體后用于下一輪篩選。通過數(shù)輪篩選，獲得與受體親和力高的噬菌體。測(cè)序：與受體親和力高的噬菌體在LB培養(yǎng)皿上感染大腸桿菌ER2738，以藍(lán)白斑實(shí)驗(yàn)挑取攜帶噬菌體的大腸桿菌克隆。擴(kuò)增12個(gè)噬菌體單克隆，并用ELISA定性法測(cè)定噬菌體與胰島素受體的親和力。提取了11個(gè)胰島素受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)陽性、且OD值較高的噬菌體克隆DNA測(cè)序，獲知連接在噬菌體

4、外殼pⅢ蛋白末端的環(huán)7肽氨基酸殘基序列。多肽親和力鑒定：固相法多肽合成儀合成環(huán)7肽，并暫時(shí)定名為CY-10。125I標(biāo)記CY-10用于與胰島素受體的體外結(jié)合分析。體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)包括飽和分析、Scachard分析、競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)等。 CY-10親腫瘤特性：比較CY-10結(jié)合肝癌細(xì)胞和正常肝細(xì)胞的差異。研究125I-CY-10在肝癌SMMC7721細(xì)胞荷瘤裸鼠體內(nèi)分布。131I標(biāo)記CY-10作肝癌SMMC7721細(xì)胞荷瘤裸鼠全身顯像，了

5、解131I-CY-10在肝癌組織的分布。 根據(jù)CY-10在荷瘤鼠的體內(nèi)分布和顯像表現(xiàn)，評(píng)價(jià)CY-10作為肝細(xì)胞癌靶向診斷和治療的可能性。 結(jié)果：●通過三輪親和篩選，每輪篩選噬菌體的回收處于同一水平。挑取第三輪篩選獲得的噬菌體克隆12個(gè)進(jìn)行擴(kuò)增，ELISA定性分析12個(gè)噬菌體與胰島素受體的結(jié)合能力，結(jié)果表明12個(gè)克隆全部為陽性反應(yīng)。挑取11個(gè)OD值較高的陽性噬菌體克隆提取DNA測(cè)序，結(jié)果顯示12個(gè)噬菌體克隆的插入序列完全相

6、同。插入序列的結(jié)構(gòu)是：ATGACGCCAATGCTTCGACTG。翻譯成多肽的序列是QSKHWRH。 ●根據(jù)測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)并人工合成環(huán)10肽C-QSKHWRH-C-Y，暫時(shí)命名為CY-10。125I-CY-10與胰島素受體結(jié)合的離解常數(shù)Kd值為8.901×10-8mol/L。與豬胰島素比較，CY-10與胰島素受體的親和力更高，IC50CY/IC50Ins=1.716。 ●CY-10和SMMC7721細(xì)胞株的結(jié)合能力高于和

7、正常肝細(xì)胞株L-02的結(jié)合能力。荷瘤裸鼠體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)顯示，腫瘤攝取高峰出現(xiàn)在注射后3小時(shí)，3小時(shí)腫瘤/肌肉的％ID/g比值為2.2218。其他組織器官攝取高峰出現(xiàn)在1小時(shí)。CY-10注射后15小時(shí)，大多數(shù)內(nèi)臟器官CY-10分布明顯下降，腫瘤組織下降幅度小，適合動(dòng)物全身顯像。24小時(shí)13I-CY-10荷肝癌鼠全身顯像示腫瘤組織攝取高于對(duì)側(cè)正常組織。 結(jié)論：1.研究獲得了一種與胰島素受體有高親和力的多肽； 2.胰島素受體高親