1、肺癌的發(fā)病率和病死率居于全球惡性腫瘤中首位,且在不斷升高。我國(guó)的肺癌現(xiàn)狀更加嚴(yán)峻,由于發(fā)病率的快速攀升,肺癌在惡性腫瘤中已居于導(dǎo)致我國(guó)城市人口死亡的病癥之首。如果沒有相應(yīng)措施來控制如吸煙和空氣污染這些肺癌的誘因,按現(xiàn)有數(shù)據(jù)推測(cè),十年以后,我國(guó)每年將有100萬人口發(fā)生肺癌,成為肺癌患病人數(shù)最多的國(guó)家。肺癌患者在早期往往沒有明顯癥狀,去醫(yī)院就診時(shí)大多已處于晚期,發(fā)生了癌轉(zhuǎn)移,錯(cuò)過了外科手術(shù)和放療的最佳時(shí)機(jī),因此得不到根治,預(yù)后很差。因此,解

2、決肺癌危機(jī)的出路在于肺癌的早期診斷。
　　免疫酶染色法(Immunoenzymatic Assay,IEA)以酶標(biāo)抗體催化底物顯色來反映抗原抗體的結(jié)合,廣泛應(yīng)用于抗原定位、病原定性鑒定等。該方法從分子層面研究肺癌的基因和表觀遺傳學(xué)特征,有助于從本質(zhì)上認(rèn)識(shí)腫瘤,從而實(shí)現(xiàn)早期診斷,顯示出優(yōu)于傳統(tǒng)的基于腫瘤組織學(xué)類型和臨床表現(xiàn)的診斷方法的巨大應(yīng)用潛力。傳統(tǒng)免疫酶法使用的是單克隆抗體或多克隆抗體,由于免疫動(dòng)物這一過程必不可少,因此制備過程

3、復(fù)雜且耗時(shí),成功率難以得到保障。本論文用噬菌體展示肽庫篩選肺癌細(xì)胞特異性結(jié)合肽來建立免疫酶染色法,具有技術(shù)難度低、制備周期短的突出優(yōu)勢(shì)。
　　噬菌體展示技術(shù)是通過基因工程手段將外源蛋白或肽段的基因克隆到噬菌體基因組DNA中,使其表達(dá)在噬菌體衣殼蛋白上,具有獨(dú)立的空間構(gòu)象。噬菌體展示技術(shù)結(jié)合了多肽的親和活性和噬菌體的可擴(kuò)增性,并將展示肽的基因型和表型統(tǒng)一在同一病毒顆粒內(nèi),實(shí)現(xiàn)了兩者間的連接和轉(zhuǎn)化,在通過“吸附-洗脫-擴(kuò)增”的重復(fù)過程

4、篩選出與靶標(biāo)特異性結(jié)合的噬菌體克隆后,通過測(cè)定基因序列可推斷展示在噬菌體表面的外源蛋白的氨基酸序列。噬菌體展示技術(shù)已被大量應(yīng)用于腫瘤研究方面,如腫瘤抗原表位的篩選、腫瘤標(biāo)志物的篩選以及腫瘤抗體的制備等,國(guó)內(nèi)外已有大量研究報(bào)道,為開發(fā)新的腫瘤診斷方法和靶向治療藥物奠定基礎(chǔ)。
　　本課題以肺腺癌A549細(xì)胞為篩選靶標(biāo),人胚肺二倍體helf細(xì)胞做反相吸附細(xì)胞,從噬菌體隨機(jī)十二肽庫中篩選出與肺癌細(xì)胞特異性結(jié)合的噬菌體多肽,用其替代一抗,酶

5、標(biāo)抗噬菌體抗體作二抗,建立檢測(cè)肺癌細(xì)胞的免疫酶染色法。4輪差減篩選后,從最后一輪的滴度檢測(cè)平板上,隨機(jī)挑取了分離良好的24個(gè)克隆進(jìn)行ELISA鑒定,得到了9個(gè)對(duì)A549細(xì)胞具有高親和力的克隆,隨后對(duì)親和力最好的5號(hào)和10號(hào)噬菌體克隆進(jìn)行細(xì)胞免疫化學(xué)鑒定,結(jié)果顯示5號(hào)噬菌體克隆的特異性優(yōu)于10號(hào)。因此用親和力和特異性最好的5號(hào)噬菌體克隆建立了檢測(cè)肺癌細(xì)胞的免疫酶法,并探討了最佳實(shí)驗(yàn)條件,即5號(hào)噬菌體滴度5×109pfu/10μl,HRP/