1、【目的】研究奧美沙坦對高糖誘導(dǎo)VSMCs增殖、遷移的影響，并探討ACE2/Ang(1-7)/Mas通路在該效應(yīng)中的作用。
　　【研究方法】
　　1.為了驗(yàn)證高濃度葡萄糖誘導(dǎo)對大鼠主動脈平滑肌細(xì)胞（VSMCs）形態(tài)及生理特征的影響，選擇離體培養(yǎng)大鼠原代胸主動脈平滑肌細(xì)胞(VSMCs)作為實(shí)驗(yàn)對象。采用第3-8代性狀穩(wěn)定的原代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。原代細(xì)胞鑒定采用組織學(xué)鑒定和免疫熒光鑒定兩種方法。組織學(xué)鑒定大鼠原代胸主動脈平滑肌(V

2、SMCs)鏡下觀呈現(xiàn)長梭性，部分可呈星形。免疫熒光鑒定采用a-SMC作為檢測抗原，大鼠原代胸主動脈平滑肌(VSMCs)胞漿內(nèi)可見呈肌絲樣條狀分布的熒光信號。
　　2.為了驗(yàn)證高濃度葡萄糖誘導(dǎo)對于大鼠主動脈平滑肌細(xì)胞(VSMCs)的影響，以及驗(yàn)證奧美沙坦對該影響是否有治療作用，實(shí)驗(yàn)分為5個(gè)處理組。分別為正常糖組(NG)、甘露醇對照組(Man)、高糖組(HG)、奧美沙坦組(Olm)、抑制劑組(A779+Olm)。正常糖組采用5.5mM

3、(1g/L)的葡萄糖濃度DMEM，高糖組是在正常糖組的基礎(chǔ)上額外補(bǔ)充葡萄糖，使培養(yǎng)體系中葡萄糖終濃度達(dá)到25mM(4.5g/L)，以保證高糖組與正常糖組除了葡萄糖濃度相異之外，其他干預(yù)因素均相同。甘露醇組是在正常糖組的基礎(chǔ)上額外補(bǔ)充19.5mM的甘露醇，使培養(yǎng)體系的滲透壓與高糖組保持一致，以排除滲透壓差異可能造成的影響。奧美沙坦組是在高糖組培養(yǎng)體系的基礎(chǔ)上加入奧美沙坦。A779+Olm組先于A779預(yù)先處理細(xì)胞30min，使細(xì)胞初步達(dá)到

4、受體抑制狀態(tài)，然后加入含A779和奧美沙坦的高糖培養(yǎng)體系，以探索ACE2/Ang（1-7）/MAS軸是否參與奧美沙坦對于高糖誘導(dǎo)細(xì)胞的作用?？紤]到細(xì)胞代謝對糖分的消耗，所有培養(yǎng)體系均每24h更新一次。
　　3.為了驗(yàn)證高濃度葡萄糖誘導(dǎo)對于大鼠主動脈平滑肌細(xì)胞(VSMCs)的增殖影響。對細(xì)胞進(jìn)行24h去血清預(yù)處理后，按預(yù)設(shè)分組處理細(xì)胞72h，處理結(jié)束后，采用MTT法檢測不同組細(xì)胞密度，從來評估細(xì)胞的增殖效益。
　　4.為了驗(yàn)證

5、高濃度葡萄糖誘導(dǎo)對于大鼠主動脈平滑肌細(xì)胞(VSMCs)細(xì)胞周期影響。對細(xì)胞進(jìn)行24h去血清預(yù)處理后，按預(yù)設(shè)分組處理細(xì)胞72h，處理結(jié)束后，采用PI單染法，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期改變。
　　5.為了驗(yàn)證高濃度葡萄糖誘導(dǎo)對于大鼠主動脈平滑肌細(xì)胞(VSMCs)細(xì)胞水平遷移影響。采用融合率達(dá)到90％以上的細(xì)胞做水平劃痕，按預(yù)設(shè)分組的無血清培養(yǎng)體系處理細(xì)胞24h，處理結(jié)束后，鏡下觀察并測量原細(xì)胞劃痕的寬度變化及細(xì)胞水平遷移情況。
　　

6、6.為了驗(yàn)證高濃度葡萄糖誘導(dǎo)對于大鼠主動脈平滑肌細(xì)胞(VSMCs)細(xì)胞水平遷移影響，以及驗(yàn)證奧美沙坦對該影響是否有治療作用。對細(xì)胞進(jìn)行24h去血清預(yù)處理后，按預(yù)設(shè)分組處理細(xì)胞72h，處理結(jié)束后，提取細(xì)胞總蛋白，Western Blot法檢測各處理組細(xì)胞中ACE2、Mas蛋白表達(dá)量的改變。
　　【結(jié)果】
　　1.與正常糖組相比，甘露醇對照組未見明顯改變，高糖組MTT結(jié)果顯示高增殖。奧美沙坦組增殖較高糖組減少，抑制劑組增殖高于奧

7、美沙坦組。
　　2.與正常糖組相比，甘露醇對照組未見明顯改變，高糖組細(xì)胞周期G0/G1比例降低。奧美沙坦組G0/G1期比例較高糖組增高，抑制劑組G0/G1期比例低于奧美沙坦組。
　　3.正常糖組24h未見明顯細(xì)胞遷移，甘露醇對照組表現(xiàn)大致同正常糖組，高糖組24h見明顯細(xì)胞外遷。奧美沙坦細(xì)胞遷移少于高糖組，抑制劑組細(xì)胞遷移明顯高于奧美沙坦組。
　　4. Western Blot結(jié)果顯示，與正常糖組相比，高糖組 ACE2、