1、食品微生物是影響食品安全的重要因素，由食源性致病菌引起的病例越來越多。致病菌往往共存于復(fù)雜的生物體系中，且個體微小、致病性高，因此，微生物檢測方法必須要高靈敏度、強特異性以及較短的分析時間。傳統(tǒng)的培養(yǎng)法，需要3~7天的時間，操作繁瑣，所用試劑復(fù)雜多樣，無法對微生物進行實時而有效的監(jiān)測和防控；而基于DNA水平的普通聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）檢測技術(shù)，雖然具有特異性強、靈敏度高、操作簡單的特點，但卻無法區(qū)分死、活細菌，使得檢測結(jié)果與現(xiàn)行的致病

2、菌檢測標準不一致，故普通PCR法只能用來對已經(jīng)分離培養(yǎng)的致病菌進行快速鑒定，而不能對樣品中的致病菌進行直接檢測。因此，建立一套快速、靈敏又能區(qū)分死、活菌的檢測方法，尤為重要。
　　本研究選取食品中代表性的致病菌，即革蘭陰性沙門菌(Salmonella)和革蘭陽性金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，分別以沙門氏菌invAmRNA與金黃色葡萄球菌femA mRNA為檢測對象，建立了一套Taqman探針一步實時

3、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)檢測法，主要有以下結(jié)論：
　　1)該一步RT-PCR測法，活菌的檢測結(jié)果顯陽性，死菌的檢測結(jié)果呈現(xiàn)陰性，能夠有效的區(qū)分死、活菌；
　　是否為陽性樣本還可采用以下方法判定：
　　若同一樣本RT-PCR的擴增Ct值與PCR的擴增Ct值相差大于等于4，則該樣本為陽性；若二者的Ct差值小于4，那么使用DNaseI再消化一次，如果再次消化后，二者的Ct差值大于等于4，那么該樣本為陽性，反之則為

4、陰性；
　　2)菌液在4℃的環(huán)境保存時，細菌的代謝活性會減弱，mRNA的表達量會下降，在進行RT-PCR檢測時，應(yīng)預(yù)先活化菌液；最佳增菌方式為：50μL菌液添加到3mLLB液體培養(yǎng)基中，200rpm、37℃震蕩培養(yǎng)3h；
　　3)離心柱式試劑盒法所提取的RNA能夠用于RT-PCR對活菌的檢測，而傳統(tǒng)TrizolRNA提取法所提取的RNA不適用于RT-PCR對活菌的檢測；
　　4)一步法與兩步法RT-PCR在檢測結(jié)果的C

5、t值上，沒有較為明顯的差異，但一步法耗時短，易于操作，檢測成本低，更適合于食源性致病菌的快速檢測；
　　5)DNA會干擾RT-PCR對mRNA的檢測，RT-PCR檢測時，需使用DNaseI除去RNA抽提液中殘留的DNA，才能有效的區(qū)分死、活菌；兩次DNaseI的使用幾乎能去除所有的殘留DNA，是否需再次使用DNaseI的判定方法：在經(jīng)RT-PCR擴增后，活菌與死菌的Ct值相差大于等于4時，可認為兩者的Ct值存在差異，可再次使用DN

6、aseI消化提取液；否則，重新實驗；
　　6)探針、引物是影響RT-PCR檢測的重要因素，將直接影響RT-PCR的定量結(jié)果；本文自設(shè)計的femA引物、探針具有高度的特異性，其RT-PCR擴增產(chǎn)物序列與金黃色葡萄球菌femA基因序列同源，相似性達100％；在DNA定量的準確性上已經(jīng)接近市售標準試劑盒水平，在靈敏度上已高于市售試劑盒；該引物、探針可用于普通試劑盒的生產(chǎn)；
　　7)該一步RT-PCR檢測法穩(wěn)定性良好，能夠檢測到處于

7、VBNC狀態(tài)下的沙門氏菌，具有較強區(qū)分死、活菌的能力；在檢出限、靈敏度上均優(yōu)于現(xiàn)行國家商檢標準；沙門氏菌：靈敏度為4×103CFU/mL，檢出限可達1CFU/3mL；最佳擴增參數(shù)為：45℃×10min；95℃×15min；94℃×20s，60℃×20s，72℃×20s，40cycles；單點熒光在72℃；選用FAM通道檢測；金黃色葡萄球菌：靈敏度為9×102CFU/mL，檢出限可達1/3CFU/3mL；最佳擴增參數(shù)為：45℃×10min