1、隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展和人口的增長(zhǎng),人類對(duì)能源的需求與日俱增,燃料乙醇作為一種清潔的可再生能源成為關(guān)注熱點(diǎn)。利用豐富而廉價(jià)的纖維素資源代替糧食淀粉生產(chǎn)燃料乙醇對(duì)社會(huì)的可持續(xù)發(fā)展具有重大意義。但纖維素酶解效率低、纖維素?zé)o法被充分利用等問(wèn)題成為纖維素乙醇生產(chǎn)大規(guī)模發(fā)展的障礙。本論文針對(duì)上述現(xiàn)狀,從構(gòu)建同時(shí)糖化發(fā)酵的重組菌和構(gòu)建利用木糖、葡萄糖共發(fā)酵的重組釀酒酵母出發(fā),進(jìn)行了以下研究:
　　 利用酵母表面展示技術(shù),將纖維素酶在釀酒酵母

2、表面固化表達(dá),構(gòu)建可以利用纖維素原料進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的重組釀酒酵母。將克隆自短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)C-9的內(nèi)切纖維素酶(EGX)與α-凝集素小亞基編碼蛋白Aga2p融合,連接入酵母整合載體Ylp5,為實(shí)現(xiàn)纖維素酶在釀酒酵母中高效、穩(wěn)定的表達(dá),將融合蛋白置于酵母強(qiáng)啟動(dòng)子PGK的控制之下,同時(shí),將融合蛋白整合入釀酒酵母染色體rDNA區(qū)域,大大提高外源基因在宿主細(xì)胞中的拷貝數(shù)。免疫熒光、免疫點(diǎn)雜交及酶活分析結(jié)果表明:

3、EGX已成功在釀酒酵母表面表達(dá);將重組釀酒酵母在以羧甲基纖維素為唯一碳源的培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵,結(jié)果表明:重組菌可以利用纖維素碳源并生成乙醇,經(jīng)過(guò)55 h的發(fā)酵,乙醇產(chǎn)量可達(dá)3.92 g·L-1;由于整合入酵母染色體中,外源基因在宿主細(xì)胞中的穩(wěn)定性增加,即使連續(xù)培養(yǎng)60世代egX基因仍可穩(wěn)定存在于宿主細(xì)胞中。
　　 木糖是纖維素水解液中含量?jī)H次于葡萄糖的一種單糖,它的充分利用是提高纖維素原料利用率的關(guān)鍵。傳統(tǒng)的乙醇發(fā)酵菌株釀酒酵母不

4、能利用木糖,但可利用其異構(gòu)體形式-木酮糖。在釀酒酵母中引入木糖還原酶基因(xyl1)和木糖醇脫氫酶基因(xyl2),可開(kāi)辟木糖代謝途徑,構(gòu)建可利用木糖進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的重組菌株。但由于兩種酶所需輔酶不同,常導(dǎo)致重組細(xì)胞內(nèi)氧化還原失衡,造成中間產(chǎn)物的積累。本文利用定點(diǎn)突變技術(shù),對(duì)來(lái)自樹(shù)干畢赤酵母(Pichia stipitis)的木糖醇脫氫酶(PsXDH)進(jìn)行突變,在一定程度上改變了其輔酶特異性。
　　 為構(gòu)建可利用木糖的重組酵母

5、,將樹(shù)干畢赤酵母木糖異構(gòu)酶、木糖醇脫氫酶(突變體)及釀酒酵母內(nèi)源木酮糖激酶分別置于PGK啟動(dòng)子之下,構(gòu)建了rDNA介導(dǎo)的多拷貝整合和URA3介導(dǎo)的單拷貝整合的重組質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)化到釀酒酵母W303-1A中,得到重組酵母SXYL123-rDNA,SXYL123-rDNA,SXYL123和SMXYL123。熒光定量PCR分析結(jié)果表明:與URA3介導(dǎo)的單拷貝整合相比,rDNA介導(dǎo)的多拷貝整合載體使外源基因的拷貝數(shù)提高了16倍;沉默信息調(diào)節(jié)因子Si

6、r2p對(duì)rDNA區(qū)域的同源重組具有抑制作用,利用Cre/LoxP系統(tǒng)將釀酒酵母中sir2基因的編碼區(qū)敲除掉,然后將rDNA介導(dǎo)的多拷貝整合質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入sir2基因敲除的釀酒酵母中,構(gòu)建重組菌△SMXYL123-rDNA。結(jié)果表明,sir2基因的敲除使rDNA區(qū)域的整合率提高了4倍。將重組菌進(jìn)行葡萄糖和木糖共發(fā)酵實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明:與對(duì)照菌株相比,重組菌的木糖利用能力及乙醇產(chǎn)率均有所提高,木糖醇脫氫酶的突變減少了中間產(chǎn)物木糖醇的積累;其中重組菌