1、研究目的:
　　肝癌是世界最常見的惡性腫瘤之一，無論是發(fā)病率還是致死率均排在前列。我國是肝癌發(fā)生的重災(zāi)區(qū)，約占全世界肝癌發(fā)生率的55％，已經(jīng)成為嚴重威脅我國人民健康和生命的重要疾病之一。目前用于肝癌治療的手段主要包括手術(shù)、放療和化療等，但是療效都不理想，副作用明顯，且腫瘤極易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，患者預(yù)后較差。近年來，伴隨分子生物技術(shù)和免疫學(xué)的飛速發(fā)展，腫瘤生物治療作為一種安全、有效的治療手段，在腫瘤綜合治療中的作用越來越突出，已逐步發(fā)展為

2、繼手術(shù)、化療和放療之后的第四大治療方法。
　　腫瘤生物治療是一類應(yīng)用細胞生物學(xué)和分子生物學(xué)手段對機體免疫系統(tǒng)或腫瘤的生長進行調(diào)節(jié)，從而抑制腫瘤生長的治療方法。具有特異性強、效果確切、毒副作用低、防止癌癥術(shù)后復(fù)發(fā)效果顯著、遠期抗癌效果良好等優(yōu)點。近年來，腫瘤生物治療的突破口在于尋找高效、特異性的靶點。STAT3是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子家族的重要成員。作為一種轉(zhuǎn)錄因子，STAT3在許多原發(fā)性腫瘤中持續(xù)性激活并過度表達?；罨腟TAT3

3、不僅能夠通過調(diào)節(jié)其靶基因來促進腫瘤細胞的增殖、抑制凋亡、影響細胞周期，而且還能通過調(diào)控腫瘤細胞分泌細胞因子促進腫瘤血管生成和免疫逃逸。因此，STAT3的異常表達與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系。
　　前期的研究結(jié)果證實，阻斷肝癌細胞中的STAT3信號通路可以明顯抑制腫瘤細胞的增殖、促進腫瘤細胞凋亡。更為重要的是，阻斷STAT3以后，肝癌細胞對NK細胞的殺傷敏感性明顯增強，且阻斷STAT3的肝癌細胞可以有效激活小鼠機體免疫系統(tǒng)對HCC

4、的免疫應(yīng)答，打破免疫耐受，產(chǎn)生有效的抗腫瘤效應(yīng)。這一結(jié)果提示我們，阻斷STAT3信號通路后，肝癌細胞的腫瘤抗原成分可能發(fā)生了改變，導(dǎo)致其免疫原性增強。因此，本研究中我們利用基因誘騙(decoy-ODN)的方法阻斷肝癌細胞中的STAT3信號通路，并通過反復(fù)凍融將其制備成腫瘤疫苗。在確定該疫苗的預(yù)防效果后，系統(tǒng)分析了其抗腫瘤機制。結(jié)果證明，連續(xù)免疫接種疫苗三次后的小鼠能夠產(chǎn)生很好的免疫記憶，當再次接種腫瘤細胞時，能夠產(chǎn)生有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答

5、，抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，延長小鼠生存期。對其抗腫瘤的機制研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤疫苗能夠增加機體T細胞和NK細胞的比例及活化水平，促進DC細胞的成熟與活化，誘導(dǎo)Th1型細胞因子的表達，誘導(dǎo)記憶性T淋巴細胞的產(chǎn)生，并抑制機體的免疫負調(diào)性細胞和分子。該研究為臨床預(yù)防及治療腫瘤提供了新的方法及實驗依據(jù)。
　　研究方法:
　　1.以不同濃度的FITC標記的Decoy-ODN對小鼠肝癌細胞H22和Hepa1-6進行轉(zhuǎn)染，通過流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染效

6、率，確定實驗轉(zhuǎn)染的最適條件。在該條件下對肝癌細胞轉(zhuǎn)染Decoy-ODN后，通過Annexin-Ⅴ/PI雙染色法檢測腫瘤細胞的凋亡情況，驗證Decoy-ODN在小鼠肝癌細胞中的效應(yīng)。
　　2.小鼠肝癌細胞轉(zhuǎn)染Decoy-ODN后，通過液氮反復(fù)凍融的方法將其制備成腫瘤疫苗。以H22細胞疫苗和Hepa1-6細胞疫苗分別對BALB/c和C57BL/6兩種小鼠模型連續(xù)免疫三次后進行荷瘤，觀察小鼠腫瘤生長情況以及生存期。
　　3.疫苗對

7、小鼠免疫三次以后，分離小鼠各組織淋巴細胞，通過流式細胞術(shù)檢測淋巴細胞各個亞群的比例和活化情況、分泌腫瘤免疫相關(guān)細胞因子的含量以及抗原遞呈細胞DC的比例及其共刺激分子的表達。以此探討免疫系統(tǒng)的活化狀態(tài)和激活免疫反應(yīng)的機制。
　　4.疫苗對小鼠免疫三次后，分離小鼠各組織淋巴細胞，檢測小鼠體內(nèi)免疫記憶性淋巴細胞的比例，探討疫苗的免疫記憶功能。并且通過體外誘導(dǎo)增殖實驗來驗證免疫記憶效果。
　　5.疫苗免疫后荷瘤的小鼠，分離各個組織淋

8、巴細胞，通過流式細胞術(shù)檢測各淋巴細胞亞群的活化狀態(tài)，以及免疫負調(diào)細胞的比例及其分泌的免疫抑制性細胞因子的含量，以此探討機體抗腫瘤免疫的機制。
　　6.通過無胸腺裸鼠進行疫苗免疫實驗，觀察荷瘤裸鼠腫瘤的生長情況以及機體免疫系統(tǒng)活化的水平，探討發(fā)揮免疫記憶功能以及抗腫瘤效應(yīng)的細胞亞群。
　　7.以荷瘤小鼠的血清孵育腫瘤細胞，通過流式細胞術(shù)檢測腫瘤細胞表面腫瘤特異性IgG的含量，探討體液免疫在腫瘤清除過程中的作用。
　　研究

9、結(jié)果:
　　1.以100nM濃度的ODN轉(zhuǎn)染小鼠肝癌細胞12h，Decoy-ODN可以有效進入肝癌細胞，并促進細胞凋亡，證明以此轉(zhuǎn)染條件處理小鼠腫瘤細胞，Decoy-ODN可以發(fā)揮阻斷STAT3的作用。
　　2.經(jīng)腫瘤疫苗免疫的小鼠，對其進行HCC荷瘤，發(fā)現(xiàn)其成瘤率明顯降低，并且腫瘤的生長速度顯著減緩，生存期延長。
　　3.經(jīng)疫苗免疫后，小鼠外周血T細胞和NK細胞的比例明顯高于對照組，并且其活化性標志CD69的表達水平

10、顯著提高，CD4+和CDS+T細胞胞內(nèi)IFN-γ和TNF-α的分泌量明顯增加。進一步分析抗原遞呈細胞DC的變化發(fā)現(xiàn)，DC細胞的比例以及其共刺激分子CD80和CD86的表達均顯著高于對照組。
　　4.通過疫苗免疫后，小鼠外周血中記憶性T細胞(CD3+CD44+CD62L+)的比例明顯高于對照組。進一步分離免疫后的小鼠的脾臟淋巴細胞，在體外利用滅活的腫瘤細胞進行刺激，發(fā)現(xiàn)處理5天后，疫苗免疫組的脾臟淋巴細胞增殖顯著增加。
　　5

11、.小鼠經(jīng)過疫苗免疫后荷瘤，其外周血以及腫瘤浸潤淋巴細胞中T細胞的比例和CD69+T比例均顯著高于對照組，并且T細胞表面脫顆粒相關(guān)分子CD107a的陽性率也顯著增加。雖然NK細胞比列沒有顯著變化，但是其CD69和CD107a表達水平均明顯升高。通過分析免疫負調(diào)細胞Treg的比例及其分泌的抑制性細胞因子的含量發(fā)現(xiàn)，疫苗免疫的小鼠荷瘤后其外周血中Treg細胞的比例明顯下降，且血清中IL-I0和TGF-β的含量明顯降低。
　　6.裸鼠經(jīng)疫

12、苗免疫后荷瘤，其腫瘤生長速度與未免疫組相比無明顯差別，體內(nèi)淋巴細胞的活化也沒有顯著變化。
　　7.血清孵育腫瘤細胞后，用anti mouse IgG抗體通過流式細胞術(shù)檢測，發(fā)現(xiàn)IgG+的腫瘤細胞比例明顯升高，表明經(jīng)疫苗免疫后小鼠血清中腫瘤特異性的IgG含量明顯升高了。
　　結(jié)論及意義:
　　本課題通過基因誘騙的手段靶向阻斷肝癌細胞的STAT3信號通路，然后將全細胞進行滅活，制備腫瘤疫苗并對小鼠進行免疫。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過疫