1、植物在其生長(zhǎng)過(guò)程中不斷地遭受外界環(huán)境的影響，促絲裂原活化蛋白激酶激酶(Mitogen-activated protein kinase kinase，MAPKK)作為MAPK級(jí)聯(lián)信號(hào)傳遞系統(tǒng)(MAPKs)的一部分，在植物響應(yīng)逆境脅迫中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用。大量研究表明，MAPKK不僅在響應(yīng)生物脅迫方面表現(xiàn)出調(diào)節(jié)功能，而且在響應(yīng)非生物脅迫方面也發(fā)揮了重要的作用。然而，目前關(guān)于MAPKK響應(yīng)外界環(huán)境脅迫的研究大多集中在擬南芥等模式植物上，有關(guān)農(nóng)

2、作物中的MAPKK基因研究很少。棉花，作為重要的農(nóng)作物之一，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)效益。因此，本研究以陸地棉（Gossypium hirsutum L.）（魯棉22）為材料，利用同源克隆的方法分離得到一個(gè)新的A組MAPKK基因，命名為GhMKK1，并對(duì)其進(jìn)行了序列比對(duì)、表達(dá)特性分析和功能鑒定，具體研究結(jié)果如下:
　　 (1)基因全長(zhǎng)序列測(cè)定表明，該基因cDNA全長(zhǎng)為1234個(gè)核苷酸，包括21bp的5’非編碼區(qū)(Untransl

3、ated region，UTR)，127bp的3'UTR和1086bp的開(kāi)放閱讀框(Openreading frame，ORF)。ORF編碼一個(gè)361個(gè)氨基酸的多肽，預(yù)測(cè)其分子量大約為39.945kDa，pI值為5.08。該基因推導(dǎo)的氨基酸序列比對(duì)及聚類分析表明，棉花GhMKK1與歐芹PcMKK2、番茄LeMKK1、擬南芥AtMKK1及AtMKK2同源性較高，這些較高同源性的基因都屬于MAPKK中的A組。以上結(jié)果表明，我們分離得到的是棉

4、花A組的MAPKK基因，并命名為GhMKK1。
　　 (2)采用RT-PCR的方法對(duì)GhMKK1基因在棉花受到外界脅迫時(shí)的表達(dá)特性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，GhMKK1轉(zhuǎn)錄水平受高鹽、機(jī)械損傷、過(guò)氧化氫(Hydrogen peroxide，H2O2)、聚乙二醇(PEG)、低溫(4。C)等非生物脅迫誘導(dǎo)而提高;棉花幼苗受棉花青枯病菌（Ralstonia solanacearum）誘導(dǎo)后，GhMKK1表達(dá)量也有所提高;激素信號(hào)分子水楊酸

5、(Salicylic acid，SA)和脫落酸(Abscissic acid, ABA)也能不同程度地誘導(dǎo)GhMKK1基因的表達(dá)，以上結(jié)果表明GhMKK1可能在自身防御過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。
　　 (3)將GhMKK1構(gòu)建35S-GhMKK1∶:GFP融合蛋白，采用基因槍方法將融合蛋白轉(zhuǎn)入到洋蔥表皮細(xì)胞中，利用熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，該基因定位于細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中，這為GhMKK1發(fā)揮功能提供了組織依據(jù)。
　　 (4)將GhM

6、KK1構(gòu)建正義植物表達(dá)載體pB I121-GhMKK1，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化本生煙（Nicotiana benthamiana）。對(duì)部分轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行RT-PCR分析，結(jié)果證明GhMKK1在轉(zhuǎn)基因本生煙中成功表達(dá)，進(jìn)一步通過(guò)自交得到T1代過(guò)表達(dá)植株。在分子鑒定基礎(chǔ)上，通過(guò)RT-PCR檢測(cè)了T1代轉(zhuǎn)基因植株中GhMKK1的表達(dá)水平。以非轉(zhuǎn)基因的本生煙為對(duì)照，超表達(dá)GhMKK1的T3代轉(zhuǎn)基因植株增加了對(duì)高鹽、干旱等非生物脅迫的抗性，我們

7、推測(cè)該基因可能正調(diào)控非生物脅迫抗性。
　　 (5)超表達(dá)GhMKK1的轉(zhuǎn)基因植株接種植物病原細(xì)菌煙草青枯病菌和病原菌棉立枯（Rhizoctonia solani）后，轉(zhuǎn)基因植株中的幾種病原相關(guān)基因的表達(dá)量較野生型植株均有所降低，轉(zhuǎn)基因植株顯示了對(duì)病原菌的敏感性。以上結(jié)果表明，GhMKK1可能在多種生物脅迫反應(yīng)中發(fā)揮一定作用，并且可能負(fù)調(diào)控生物脅迫抗性。
　　 綜上所述，GhMKK1提高了轉(zhuǎn)基因植株對(duì)非生物脅迫的抗性，表現(xiàn)