1、近年來隨著化石燃料消費的不斷提高導致了越來越嚴重的能源危機和環(huán)境問題，微藻生物柴油作為一種優(yōu)勢明顯新興能源越來越受到人們的重視。本研究的目的對微藻生物柴油的開發(fā)利用中兩項關鍵技術進行研究，為微藻生物柴油的廣泛利用提供一定的技術支持。在利用微藻制備生物柴油時，用基因操作能有效、穩(wěn)定的提高微藻的產(chǎn)油率。其中，選擇合適的藻種、目的基因是基因操作的關鍵。本研究選擇了生長速率較高，可在海水中生長的海水小球藻作為藻種，海水小球藻pepc2基因作為目

2、的基因進行研究。首先通過克隆和生物信息學方法分析了海水小球藻pepc2基因的結(jié)構(gòu)特征；再通過反義原核表達分析了海水小球藻pepc2基因的功能。除此之外，本研究還探索了基于光反應器的微藻規(guī)?；囵B(yǎng)技術，利用本課題組設計的100L光反應器規(guī)?；囵B(yǎng)微藻，分析其生長規(guī)律和調(diào)控方式。
　　PEPC酶(PEPCase:EC4.1.1.31)是光合碳代謝過程中的一個重要的酶，它催化磷酸烯醇式丙酮酸β-羧化生成草酰乙酸和無機磷酸。近20年來，研

3、究發(fā)現(xiàn)在非C4和CAM植物，如藻類中也廣泛存在這種酶，并且證明在真核藻類中存在兩種類型PEPC酶，但對其功能尚不清楚。為了進一步了解藻類 PEPC酶的特征，本文對海水小球藻pepc2基因進行了首次克隆并通過生物信息學方法分析了海水小球藻PEPCase2的結(jié)構(gòu)和功能特征。主要實驗結(jié)果如下：1.系統(tǒng)進化分析表明海水小球藻pepc2基因與萊茵衣藻pepc2基因親緣關系較近；氨基酸序列特征分析表明海水小球藻PEPCase2的肽鏈共包含5個保守序

4、列區(qū)，2個催化活性位點，其N端缺乏絲氨酸可逆磷酸化位點，C端為RNTG結(jié)構(gòu)。由此可知該基因編碼的是海水小球藻細菌型PEPC酶；2.海水小球藻 PEPCase2二級結(jié)構(gòu)主要包括α螺旋，β轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲和伸展鏈；其三級結(jié)構(gòu)外部為α螺旋結(jié)構(gòu)和無規(guī)則卷曲，有利于保持PEPC酶結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，中心的平行β桶結(jié)構(gòu)為PEPC酶的反應中心；3.海水小球藻 PEPCase2具有多種重要的生理功能，主要與多種重要的物質(zhì)合成有關。
　　本研究用反義載體

5、技術在大腸桿菌中反向表達了海水小球藻pepc2基因片段，抑制PEPC酶活性從而提高油脂含量。通過PCR擴增獲得的海水小球藻pepc2基因片段經(jīng)測序為611bp，與海水小球藻pepc2基因相似度為100％，該片段編碼海水小球藻PEPCase2保守序列Ⅰ。將該片段插入 pET-28a構(gòu)建正向（pET-28a-forw-pepc2）和反向（pET-28a-reve-pepc2）表達載體，并導入到大腸桿菌獲得正義和反義轉(zhuǎn)基因大腸桿菌。在誘導條件

6、下培養(yǎng)，與野生型相比，誘導6h時正向表達突變體pepc基因相對表達量、PEPC酶活性、可溶性蛋白含量分別提高至215.74%、5.59 U/g prot和216.96mg/g biomass而總油脂下降至3.67%；反向表達突變體則相應分別下降到41.23%、2.83U/g prot和139.19mg/g biomass，總油脂提高了24%。表明pepc基因在大腸桿菌蛋白和脂類代謝方面起著重要調(diào)控作用。
　　為了實現(xiàn)微藻的規(guī)模化培