受體相互作用蛋白激酶3轉錄調(diào)節(jié)特性研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:探討受體相互作用蛋白激酶3(receptor interacting protein kinase3, RIPK3)基因啟動子功能序列與轉錄因子的相互作用及其CpG島甲基化狀態(tài)與基因表達水平的關系。
  方法:(1)采用生物信息學預測并分析啟動子序列后,行啟動子缺失突變轉化分析,即PCR方法對RIPK3基因不同長度的序列片段進行擴增,以熒光素酶載體構建質(zhì)粒,轉染人胚腎細胞(293T細胞),采用化學發(fā)光儀檢測區(qū)域啟動活性,鑒定

2、功能啟動子的可能區(qū)域。利用軟件預測轉錄因子結合位點,并通過突變轉化分析鑒定RIPK3基因核心轉錄因子的結合位點。(2)在293T細胞中,通過檢測過表達轉錄因子刺激蛋白1(stimulating protein1, Sp1)/刺激蛋白3(stimulating protein3, Sp3)和Sp1/Sp3顯性負突變體后以及基因選擇性Sp1抑制劑光神霉素處理后啟動子活性的檢測研究轉錄因子刺激蛋白家族與RIPK3啟動子之間的關系。(3)采用凝

3、膠電泳遷移分析(Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA)檢測轉錄因子Sp1/Sp3與RIPK3啟動子之間的相互作用關系。(4)采用RNA干擾技術檢測轉錄因子Sp1/Sp3在293T細胞中與RIPK3啟動子的相互作用以及在人大腸癌細胞(HT-29細胞)中與RIPK3表達的作用情況。(5)采用亞硫酸氫鹽修飾后測序法(Bisulfite sequencing PCR, BSP)研究在表達與不表達R

4、IPK3的細胞系中以及甲基化抑制劑處理后的不表達RIPK3的細胞系中甲基化在RIPK3基因啟動子區(qū)域的修飾情況。
  結果:(1)化學發(fā)光實驗表明:RIPK3基因的5'非翻譯區(qū)(5'-non-translated region,5'UTR)和轉錄起始位點(transcriptional start site, TSS)上游19個堿基片段是RIPK3基因啟動子的功能序列;缺失突變轉化分析提示該功能序列包含三個GC盒(GC box),

5、其中第二個為RIPK3基因轉錄因子Sp1/Sp3的核心結合位點。(2)過表達研究結果表明,Sp1/Sp3對RIPK3基因啟動子活性激活起主導作用。(3)凝膠電泳遷移分析的結果證實轉錄因子Sp1/Sp3與GC富集區(qū)特異性相互作用。(4)Sp1小干擾RNA或 Sp3小干擾RNA與RIPK3啟動子功能區(qū)和熒光素酶載體構建的質(zhì)粒共同轉染293T細胞,比較得出RIPK3啟動子活性明顯減低。(5)亞硫酸氫鹽修飾后測序法實驗結果表明,在表達RIPK3

6、的HT-29細胞系中RIPK3基因啟動子功能序列低度甲基化,在不表達RIPK3的結腸癌細胞(HCT-116細胞)中RIPK3啟動子功能序列呈現(xiàn)高度甲基化。5-氮-2'-脫氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine,5-aza-CdR)處理后,HCT-116細胞里RIPK3啟動子功能序列甲基化的頻率明顯下降,RIPK3表達相應上調(diào)。
  結論: RIPK3基因的5'UTR及TSS上游19個堿基序列片段是RIPK3基因啟動子

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