1、乳酸菌蛋白酶直接作用于乳中的酪蛋白，是乳酸菌降解系統(tǒng)的第一步，對乳酸菌在乳中的生長至關重要，對發(fā)酵乳制品風味和質(zhì)地的形成以及品質(zhì)具有重要的影響。本論文以實驗室從傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離的乳酸菌為研究對象，確定具有促進凝乳質(zhì)量蛋白酶的乳酸菌，研究其蛋白酶性質(zhì)及其對凝乳理化性質(zhì)和凝塊品質(zhì)的影響，旨在通過研究乳酸菌蛋白酶特性來選擇優(yōu)良酸奶生產(chǎn)用菌種，為高品質(zhì)發(fā)酵乳的生產(chǎn)提供理論依據(jù)和基礎。
　　通過對現(xiàn)有乳酸菌發(fā)酵乳的質(zhì)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)123株乳

2、酸菌中有69株具有結(jié)實的凝乳效果，依據(jù)這69株乳酸菌蛋白水解度的不同，篩選出12株凝乳結(jié)實且蛋白水解度高的乳酸菌，并對篩選菌株的蛋白水解力和蛋白酶活力進行研究，發(fā)現(xiàn)同一種屬的不同菌株水解蛋白的能力也存在顯著差異。分析篩選菌株的蛋白水解度和發(fā)酵性能，發(fā)現(xiàn)中等程度的蛋白水解有利于凝膠硬度的增加，而發(fā)酵乳表觀黏度隨著蛋白水解度的增加而降低，菌株蛋白水解度對發(fā)酵乳粒度的影響不顯著。通過研究這12株乳酸菌蛋白酶粗酶對葡萄糖酸內(nèi)酯（GDL）乳凝膠質(zhì)

3、量的影響，篩選出3株對GDL乳凝膠質(zhì)量促進作用最顯著的菌株CH9-34.0、SH34.3和SB5。經(jīng)16S rDNA序列分析和API細菌鑒定系統(tǒng)，確定這3株菌屬于德氏乳桿菌保加利亞亞種。
　　為獲得上述3株保加利亞乳桿菌蛋白酶，本論文對分離純化的方法和參數(shù)條件進行了優(yōu)化，確定了最適合乳酸菌蛋白酶提取純化的方法和條件。乳酸菌細胞經(jīng)溶菌酶處理獲得胞外蛋白酶，再經(jīng)超濾濃縮獲得粗酶液，依次進行DEAE弱陰離子交換層析和HiTrap But

4、yl弱疏水層析。最終得到電泳純的保加利亞乳桿菌CH9-34.0、SH34.3和SB5蛋白酶，其分子量分別為39、40和52 kDa，得率分別為46.6％、39.3%和40.4%，分別被純化了42.8、32.6和31.9倍，純化后各菌株蛋白酶的比酶活分別為54.4，80.3和61.1 U/mg。
　　研究上述3株保加利亞乳桿菌純化蛋白酶的酶學性質(zhì)，結(jié)果表明，這3株乳酸菌純化蛋白酶的最適反應溫度均為42℃，在4~50℃比較穩(wěn)定；最適反

5、應pH均為6.0左右，在pH5.5~7.0比較穩(wěn)定；Ba2+、Zn2+、Mn2+、Sn2+、Fe3+等離子明顯抑制蛋白酶活力，F(xiàn)e2+離子顯著增加蛋白酶活力，EDTA和PMSF明顯抑制酶活力，說明這3株保加利亞乳桿菌蛋白酶是金屬離子蛋白酶和絲氨酸蛋白酶。
　　將純化獲得的保加利亞乳桿菌蛋白酶以活力20 U/g蛋白質(zhì)添加到發(fā)酵乳中，利用激光共聚焦、熒光染色、納米激光粒度分析等技術(shù)，研究其對發(fā)酵乳凝膠質(zhì)量的影響，結(jié)果證實乳酸菌蛋白酶組

6、分可以顯著（P<0.05）提高發(fā)酵乳凝膠的凝膠硬度、稠度以及表觀黏度。保加利亞乳桿菌蛋白酶處理能夠明顯增加發(fā)酵乳凝膠樣品聚集體粒徑D(4,3)和D(3,2)；顯著（P<0.05）降低發(fā)酵乳凝膠樣品蛋白質(zhì)表面負電荷，促進表面電荷達到靜電平衡；蛋白酶的水解作用顯著（P<0.05）增加游離Ca2+含量，而顯著（P<0.05）減少凝膠結(jié)構(gòu)中酪蛋白結(jié)合的Ca2+含量；乳酸菌蛋白酶作用后的發(fā)酵乳樣品孔洞小、凝膠結(jié)構(gòu)均勻細膩、連接緊密；保加利亞乳桿菌