1、抗體作為免疫分析的核心試劑，其制備技術(shù)一直是制約免疫分析法在農(nóng)藥殘留分析中應(yīng)用的瓶頸因素，因此尋求一種新的抗體制備方法對(duì)農(nóng)殘免疫分析具有重要的意義。
　　本研究利用噬菌體抗體庫技術(shù)和基因工程技術(shù)，制備了擬除蟲菊酯單鏈抗體，并對(duì)抗體的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及其與抗原的特異性作用進(jìn)行了分析。首先，從分泌擬除蟲菊酯單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株2G2E7中提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，利用兼并引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得了長度約350 b

2、p的重鏈可變區(qū)基因和約325 bp的輕鏈可變區(qū)基因，再經(jīng)重疊延伸PCR獲得了750 bp左右的單鏈抗體(scFv)基因。經(jīng)過內(nèi)切酶SfiⅠ和NotⅠ對(duì)scFv和pCANTAB5E載體進(jìn)行酶切、連接和熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1，最終獲得了庫容大小2.3×107的擬除蟲菊酯初級(jí)抗體庫，陽性率為100％。利用抗原對(duì)抗體庫進(jìn)行淘選，通過五輪淘選，有效地富集了擬除蟲菊酯特異性噬菌體抗體，第五輪淘選后的噬菌體陽性率為95％;隨機(jī)挑取五輪淘選后的單克隆

3、進(jìn)行測序，得到3個(gè)scFv基因。將3個(gè)基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增、EcoRⅠ和XhoⅠ酶切后，與pET-26b載體進(jìn)行連接，成功構(gòu)建重組表達(dá)載體scFv-pET26b。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株BL21，最終得到3個(gè)scFv-pET26b重組表達(dá)菌株。對(duì)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，經(jīng)超聲破碎及SDS-PAGE檢測，結(jié)果顯示在0.1 mM IPTG，200 rpm，25℃低溫誘導(dǎo)12h條件下，3個(gè)scFv蛋白能成功表達(dá)，重組蛋白主要以包涵體的形式存在于細(xì)胞內(nèi)，

4、少量以可溶形式存在。利用間接競爭ELISA初步鑒定3個(gè)scFv的活性，結(jié)果表明:擬除蟲菊酯2號(hào)單鏈抗體(PBAscFv2)對(duì)氰戊菊酯具有一定的結(jié)合活性，10μg/mL標(biāo)品濃度下抑制率約為20％。序列分析結(jié)果顯示PBAscFv2蛋白共245個(gè)氨基酸，重鏈123個(gè)氨基酸，輕鏈107個(gè)氨基酸，柔性連接肽15個(gè)氨基酸;經(jīng)SOPMA軟件分析，PBAscFv2二級(jí)結(jié)構(gòu)中含α螺旋21處，β折疊109處，β轉(zhuǎn)角23處，隨機(jī)卷曲92處;利用CPH mod

5、els3.2 Server對(duì)PBAscFv2的空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行模擬，并利用DiscoveryStudio2.5軟件將PBAscFv2與氰戊菊酯分子進(jìn)行對(duì)接，結(jié)果顯示抗原抗體結(jié)合區(qū)域由三部分構(gòu)成:①抗體重鏈高可變區(qū)CDR3區(qū)(VH-CDR3)殘基Met106、Asp107、Tyr108和Trp109;②輕鏈框架Ⅲ區(qū)(VL-FR3)殘基Thr91和Ser92;③輕鏈高可變區(qū)CDR2區(qū)(VL-CDR2)殘基Ala41、Ser42和Pro43。