1、原果膠酶是能水解不溶性果膠物質(zhì)為可溶性果膠物質(zhì)的一類酶。1978年Sakai等首次報道了酵母生產(chǎn)的原果膠酶，之后相繼報道了細菌、酵母和霉菌中的原果膠酶的酶學性質(zhì)及原果膠酶的應用。在中國，有關(guān)微生物原果膠酶的研究和應用技術(shù)還未見報道，原果膠酶基因在Pichiapastoris中表達的研究在國內(nèi)外未見報道。本論文主要報道了產(chǎn)原果膠酶B.subtilisXZ2的篩選、原果膠酶基因在Pichiapastoris中克隆表達、重組原果膠酶的純化和酶

2、學性質(zhì)等研究內(nèi)容，研究的主要結(jié)果如下：1.通過對本研究室保藏的菌種進行篩選，獲得了一株產(chǎn)原果膠酶的B.subtilisXZ2。以B.subtilisXZ2的基因組DNA為模板，PCR擴增得到原果膠酶基因。測序結(jié)果表明：B.subtilis原果膠酶基因全長1200bp，編碼399個氨基酸，與GenBank中收錄的B.subtilis的原果膠酶基因(GenBankAccession：X74880)相比較，有4個堿基發(fā)生了替換，其同源性為99

3、.6％，編碼的氨基酸序列同源性為99.5％，二者原果膠酶蛋白基因相應的氨基酸序列、氨基酸殘基個數(shù)、位置幾乎完全相同，僅有2個氨基酸不同。同時，替換的氨基酸不位于原果膠酶的兩個保守區(qū)域。 2.擴增的原果膠酶基因與畢赤酵母載體pPICZαA經(jīng)限制性內(nèi)切酶XhoI和XbaI雙酶切，回收片段經(jīng)T4DNAligase、16℃過夜連接，連接產(chǎn)物經(jīng)CaCl2轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，獲得重組酵母表達載體pPICZαA-PPase。經(jīng)限制性內(nèi)切

4、酶BstXI線性化的pPICZαA-PPase載體與酵母感受態(tài)細胞X-33在1500V，25μF，200Ω條件下電轉(zhuǎn)化，經(jīng)過100、200、400、800μg和1000μg/mlzeocin篩選和酵母基因組PCR鑒定，最終獲得重組表達菌株X-33/pPICZαA-PPase。 3.對影響X-33/pPICZαA-PPase表達原果膠酶的培養(yǎng)基、誘導時間、甲醇濃度、誘導前菌體生長量、誘導培養(yǎng)基pH以及PTM1添加量等因素進行了研究

5、，結(jié)果顯示在使用BMGY/mBMMY培養(yǎng)基、誘導環(huán)境pH6.0、0.006％PTM1、誘導前最佳菌體0D600為6-8、1％甲醇誘導、轉(zhuǎn)速240r/min，30℃誘導培養(yǎng)96h，可以獲得較好的表達水平；高密度發(fā)酵階段，控制溶氧20％，氨水流加控制培養(yǎng)基pH6.0，經(jīng)過210h發(fā)酵培養(yǎng)菌體光密度超過了250，濕菌體達到了192g/L，蛋白含量為3.21g/L，原果膠酶活性達到最高240.2U/ml。 4.搖瓶發(fā)酵獲得的原果膠酶粗酶液

6、經(jīng)過硫酸銨沉淀、SephadexG75凝膠過濾和SepharoseFastFlow離子交換層析分離，比活力分別提高為219.27U/mg、752.48U/mg、1948.64U/mg，純化倍數(shù)分別為2.13、7.31和18.91，最終獲得的原果膠酶經(jīng)SDS-PAGE電泳測定分子量為43.17kDa。 5.原果膠酶最適作用溫度和pH分別50℃和7.0。在pH3-10范圍內(nèi)，原果膠酶活性很穩(wěn)定，熱穩(wěn)定性為50℃以下。金屬離子對于原果膠