1、Klebsiella pneumoniae是最具工業(yè)化應(yīng)用前景的2，3-丁二醇生產(chǎn)菌株之一，文獻(xiàn)報(bào)道其合成的是內(nèi)消旋2，3-丁二醇和2S，3S丁二醇兩種立體異構(gòu)體的混合物，但是本研究發(fā)現(xiàn)其合成的2，3-丁二醇是三種立體異構(gòu)體的混合物。針對(duì)這一現(xiàn)象，本研究通過(guò)構(gòu)建2，3-丁二醇合成途徑相關(guān)基因缺失的突變株并對(duì)突變株代謝特性進(jìn)行研究，結(jié)合相關(guān)酶蛋白體外催化特性，解析了K.pneumoniae2，3-丁二醇三種立體異構(gòu)體的合成途徑。構(gòu)建的突變

2、株中，K.pneumoniae△budC具有較高的R-乙偶姻合成能力，對(duì)其用于R-乙偶姻生產(chǎn)進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。在突變株的構(gòu)建過(guò)程中，對(duì)菌株基因同源重組方法進(jìn)行了研究，開發(fā)了一種通過(guò)敲除菌株recB基因來(lái)提高重組效率的方法。
　　K.pneumoniae利用葡萄糖和甘油為碳源合成的2，3-丁二醇中三種立體異構(gòu)體的比例不同，利用甘油為碳源合成的2R，3R-丁二醇比例明顯提高，推測(cè)甘油代謝相關(guān)酶可能參與2R，3R-丁二醇合成。dhaD

3、編碼甘油脫氫酶，該基因突變菌株K.pneumoniae△dhaD失去了合成2R，3R-丁二醇的能力，其他代謝產(chǎn)物無(wú)顯著變化，表明2R，3R-丁二醇合成依賴于該基因的活性。budA編碼α-乙酰乳酸脫羧酶，該突變株的內(nèi)消旋2，3-丁二醇和2R，3R-丁二醇合成能力顯著降低，而2S，3S-丁二醇合成不受影響。budC編碼丁二醇脫氫酶，該基因的突變株K.pneumoniae△budC內(nèi)消旋2，3-丁二醇合成能力顯著降低，而2R，3R-丁二醇合成

4、顯著提高。該菌利用葡萄糖為碳源時(shí)在發(fā)酵液中大量積累的R-乙偶姻，利用甘油為碳源時(shí)合成高水平2R，3R-丁二醇。
　　將dhaD和budC分別克隆連接到表達(dá)質(zhì)粒，在大腸桿菌中進(jìn)行高水平表達(dá)，并利用組氨酸標(biāo)簽對(duì)酶蛋白進(jìn)行分離純化。純化后的酶蛋白進(jìn)行體外酶促反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甘油脫氫酶在酮基和羥基的氧化還原反應(yīng)中對(duì)R構(gòu)型羥基具有特異選擇性，催化R-乙偶姻轉(zhuǎn)化為2R，3R-丁二醇，催化S-乙偶姻轉(zhuǎn)化為meso-2，3-丁二醇;丁二醇脫氫酶有S

5、-立體對(duì)映選擇性，催化R-乙偶姻轉(zhuǎn)化成meso-2，3-丁二醇，催化雙乙酰到S-乙偶姻，進(jìn)一步合成2S，3S-丁二醇。
　　根據(jù)突變株代謝特征結(jié)合酶促反應(yīng)結(jié)果，解析出2，3-丁二醇立體異構(gòu)體合成途徑機(jī)制為:菌株經(jīng)乙酰乳酸脫羧酶形成R-乙偶姻，R-乙偶姻經(jīng)過(guò)丁二醇脫氫酶催化還原形成內(nèi)消旋2，3-丁二醇。同時(shí)R-乙偶姻在甘油脫氫酶的催化下形成2R，3R-丁二醇。乙酰乳酸自發(fā)裂解形成的雙乙酰在丁二醇還原酶的催化下形成S-乙偶姻，S-乙偶

6、姻經(jīng)過(guò)丁二醇脫氫酶還原成2S，3S丁二醇。同時(shí)S-乙偶姻也可由甘油脫氫酶還原形成meso-2，3-丁二醇。
　　K.pneumoniae△budC合成R-乙偶姻的研究發(fā)現(xiàn)，菌株具有很高的R-乙偶姻積累能力，48 h發(fā)酵水平達(dá)到58.99 g/L。進(jìn)一步對(duì)菌株中能消耗R-乙偶姻的甘油脫氫酶基因dhaD和乙偶姻脫氫酶復(fù)合物基因aco進(jìn)行了敲除工作，構(gòu)建了雙基因缺失突變株和三基因缺失突變株。但是發(fā)酵結(jié)果顯示這些突變株乙偶姻產(chǎn)量沒(méi)有明顯增

7、加。
　　突變株構(gòu)建過(guò)程使用Red重組酶輔助的同源重組方法。在K.pneumoniae中重組效率較大腸桿菌中低，同時(shí)抗性合中所需要的同源臂較長(zhǎng)。分析原因可能是Gam亞基對(duì)宿主細(xì)胞的RecBCD的核酸外切酶活性抑制較弱。構(gòu)建缺失gam基因的重組酶質(zhì)粒和recB基因缺失突變株。缺失gam基因的Red重組酶重組效率較完整Red重組酶有顯著降低，表明Gam亞基對(duì)K.pneumoniae的RecBCD的核酸外切酶活性具有抑制作用。Red重組