1、近年來,全球食品安全惡性事件頻發(fā),食品安全問題是影響公共健康的重要因素,已經(jīng)成為社會關(guān)注的熱點。其中,細菌性食物中毒是導致各種食品安全惡性事件的主要原因。因此,食源性致病微生物的檢測是食品衛(wèi)生安全檢測中一個重要的部分。目前,食源性致病微生物主要采用分離、培養(yǎng)然后生化鑒定的方法,操作繁瑣,檢測時間較長,通常需要3-5d才能完成,且每次只能檢出一種致病菌,靈敏度較低。因此,建立快速、高效、準確的食源性致病菌檢測方法迫在眉睫。近年來,PCR技

2、術(shù)發(fā)展十分迅速。多重PCR技術(shù)可以實現(xiàn)在一個反應(yīng)管中同時對多種致病微生物的檢測,具有高效、低成本、高靈敏度等優(yōu)點。因此,本研究建立了食品中金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和蠟樣芽胞桿菌的多重PCR檢測技術(shù)。
　　 本文根據(jù)金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶基因(nuc)、沙門氏菌的侵染上皮細胞表面蛋白基因(invA)和蠟樣芽胞桿菌的溶血素基因(hblA)設(shè)計了3對特異性引物,進行多重PCR反應(yīng),可實現(xiàn)對三種致病菌的同時檢測。試驗過程中對反應(yīng)體系

3、中退火溫度、Mg2+、dNTPMixture、Taq酶和反應(yīng)循環(huán)數(shù)等影響因素進行優(yōu)化,確定了最適多重PCR反應(yīng)體系和循環(huán)參數(shù)。該反應(yīng)體系為:2.5μL10xPCRbuffer,2.0μLMgSO4,2.0μLDntpMixture,上游引物各1μL,下游引物各1μL,0.5μLTaq酶(5U),三種致病菌DNA模板各2.0μL,加ddH2O至25μL。循環(huán)參數(shù):采用冷啟動,94℃預變性5min;94℃變性40s,59℃退火40s,72℃

4、延伸40s,30個循環(huán);72℃終延伸10min。
　　 在此條件下,檢測了22株菌,4株金黃色葡萄球菌、4株沙門氏菌和4株蠟樣芽胞桿菌均為陽性結(jié)果,而其它10株菌均為陰性結(jié)果。將三種致病菌隨機組合,均能被檢出。將多重PCR擴增產(chǎn)物膠回收進行核苷酸測序,將測序結(jié)果網(wǎng)上BLAST,證實擴增產(chǎn)物與已知序列的同源性均達到99％,因而該多重PCR反應(yīng)特異性強。
　　 本研究用該方法直接檢測純菌液,普通熱裂解法提取DNA模板,金黃色

5、葡萄球菌的靈敏度為103CFU/ML,沙門氏菌的靈敏度為104CFU/Ml,蠟樣芽胞桿菌的靈敏度為103CFU/ML;同時檢出三種致病菌的靈敏度達到104CFU/ML。
　　 本研究采用五種不同方法從樣品中提取三種致病菌DNA模板進行多重PCR反應(yīng),比較DNA模板提取方法的優(yōu)劣。結(jié)果顯示,采用溶劑提取熱裂解法提取DNA模板效果好,操作較簡便,且價格較低廉。該多重PCR反應(yīng)檢測人工污染純牛奶,采用溶劑提取熱裂解法提取DNA模板,金

6、黃色葡萄球菌檢出限為102CFU/ML,沙門氏菌檢出限為104CFU/ML,蠟樣芽胞桿菌檢出限為102CFU/ML,同時檢出三種致病菌的檢出限達到104CFU/ML。
　　 對市場上購買的50份樣品進行檢測,并與國標方法對比,多重PCR方法檢測樣品中金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和蠟樣芽胞桿菌的敏感性均為100%;特異性:金黃色葡萄球菌93.5%、沙門氏菌94.7%、蠟樣芽胞桿菌90.6%;符合率分別為96%、本研究成功建立了多重PC