1、近年來(lái)，食品安全事件頻發(fā)，不僅影響到人們的生活、工作和健康，更是關(guān)系到國(guó)計(jì)民生的大事。在各種食物中毒中，細(xì)菌性食物中毒則是食物中毒的主要因素，常見(jiàn)的食源性致病菌包括沙門氏菌屬、變形桿菌屬、副溶血性弧菌、葡萄球菌及毒素、肉毒梭菌毒素、蠟樣芽胞桿菌、韋氏梭菌、彎曲桿菌、李斯特菌、致病性大腸桿菌、結(jié)腸炎耶爾森氏菌、志賀氏菌屬。本文針對(duì)在我國(guó)食物中毒中最常見(jiàn)的致病菌進(jìn)行研究，尋求食物中毒診斷及食品檢測(cè)的有效方法。
　　 本文涉及的食源性

2、致病菌蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)、沙門氏(Salmonellaspp)、大腸埃希氏菌0157：H7(E.coli-0157：H7)、志賀氏菌(Shigella spp)、金黃色葡萄球菌（Sta.Aureus）、單增李斯特氏桿菌（Listeria monocy togenes）等菌屬或菌。通過(guò)大量的文獻(xiàn)參考和實(shí)驗(yàn)，我們經(jīng)過(guò)篩選挑取種或?qū)匍g特異的序列及相應(yīng)引物，然后用這些引物對(duì)各種細(xì)菌的基因組序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)其特異

3、性，最終決定出用于檢測(cè)的最優(yōu)的目的基因及沙門氏菌的invA基因、單增李斯特菌溶血素hlyA基因和金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶Nuc基因、志賀氏菌的侵染性質(zhì)?？乖璈基因ipaH、、大腸埃希O157:H7的溶血素基因hlyAB、和致病性蠟樣芽孢桿菌的溶血素hblA基因設(shè)計(jì)了6對(duì)特異性引物,建立兩套三重PCR試劑盒，可同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)六種食源性致病菌的檢測(cè)。試驗(yàn)過(guò)程中對(duì)多重PCR反應(yīng)體系中引物添加量、鎂離子濃度、dNTPmixture添加量及退火溫度和

4、循環(huán)數(shù)等影響要素進(jìn)行優(yōu)化，確定了適宜的多重PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序，即優(yōu)化的三重PCR反應(yīng)為：50uL反應(yīng)體系中，dNTP終摩爾量為10pmol，Mg2+75pmol，5U Taq酶，hlyAB、ipaH和hblA終摩爾量分別為5pmol、5pmol和20pmol，invA、hlyA和nuc終摩爾量分別為7.5 pmol、10 pmol和10 pmol，10×PCR反應(yīng)緩沖液5uL；兩套試劑盒共同的擴(kuò)增條件為：預(yù)變性(94℃，5 min

5、)；28個(gè)循環(huán)：變性(94℃,30 s)，退火(58℃,40 s)延伸(72℃,70 s);延伸:(72℃，12min)。對(duì)多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，進(jìn)行DNA測(cè)序，登錄Genebank將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行網(wǎng)上blast，從而證實(shí)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物確為目的擴(kuò)增產(chǎn)物，因此該多重PCR反應(yīng)特異性較強(qiáng)。
　　 本方法通過(guò)人工污染肉及肉制品，同時(shí)檢測(cè)六種食源性致病菌的靈敏度，O157:H7檢出極限為19.8 cfu/mL，志賀氏菌檢出極限可

6、達(dá)17 cfu/mL，蠟樣芽孢桿菌檢出極限為17.7cfu/mL。沙門氏菌檢出極限為4.7 cfu/mL，單核細(xì)胞增生李斯特菌檢出極限可達(dá)17 cfu/mL，金黃色葡萄球菌檢出極限為4.5 cfu/mL。應(yīng)用建立的兩套試劑盒，本研究對(duì)山東省泰安市及周邊地區(qū)致病菌流行情況進(jìn)行了調(diào)查監(jiān)測(cè)，在各大農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，家禽集散市場(chǎng)，屠宰市場(chǎng)，街道零售商處進(jìn)行大批量采樣檢測(cè)，共取樣502份，包括糞便、羽毛、屠宰沖刷水、屠宰器具、新鮮屠宰雞只、冷凍雞只。其中

7、159樣品檢出沙門氏菌陽(yáng)性，感染率31.7％，56份樣品檢出蠟樣芽胞桿菌陽(yáng)性，感染率11.2％,45份樣品檢出O157陽(yáng)性，感染率9.0％,26份檢出單增李斯特菌陽(yáng)性，感染率為5.2％,3份檢出金黃色葡萄球菌陽(yáng)性，感染率為0.6％,3份樣品檢出志賀氏菌陽(yáng)性，感染率0.6％。將多重PCR方法結(jié)果與國(guó)家微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)法進(jìn)行比較，符合率為為100％。結(jié)論：本研究建立的兩套試劑盒可以同時(shí)檢測(cè)上述6種病原菌，可用于食品及其原料的生物安全監(jiān)測(cè)，也可