1、快速、有效、高通量地對(duì)食源性致病菌進(jìn)行檢測與識(shí)別對(duì)于疾病預(yù)防與控制十分重要。食源性致病菌多種多樣，如何從一系列懷疑對(duì)象中確定特定的病原已成為亟待解決的重要課題。本論文綜合運(yùn)用實(shí)時(shí)PCR、多色組合探針編碼(MCPC)技術(shù)和相同標(biāo)簽輔助-無引物二聚體(HAND)系統(tǒng)，致力于對(duì)食源性致病菌的廣譜檢測與識(shí)別。 第一章，綜述食源性致病菌的檢測現(xiàn)狀，介紹傳統(tǒng)檢測方法、免疫學(xué)檢測方法和分子生物學(xué)檢測方法的應(yīng)用現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢。針對(duì)目前實(shí)時(shí)PCR

2、存在檢測通量偏低的問題，分析其中的技術(shù)瓶頸，提出采用多色組合探針編碼技術(shù)的思路。 第二章，通過改良分子信標(biāo).多重?zé)晒釶CR的方法實(shí)現(xiàn)食源性致病菌的廣譜檢測。本章選擇7種致病弧菌作為研究對(duì)象，通過兩個(gè)四色實(shí)時(shí)PCR體系實(shí)現(xiàn)了7種弧菌的同時(shí)檢測，該體系具有特異性好、靈敏度高、快速簡便等優(yōu)點(diǎn)。第一個(gè)四色實(shí)時(shí)PCR體系能同時(shí)對(duì)O1群霍亂弧菌、O139群霍亂弧菌、副溶血弧菌及其毒力株進(jìn)行檢測，對(duì)單一目標(biāo)菌的檢測靈敏度可達(dá)29.6-630

3、CFU/反應(yīng)；第二個(gè)四色實(shí)時(shí)PCR體系能同時(shí)對(duì)創(chuàng)傷弧菌、擬態(tài)弧菌、溶藻弧菌和河弧菌進(jìn)行檢測，對(duì)單一目標(biāo)菌的檢測靈敏度可達(dá)29.5-295 CFU/反應(yīng)。 第三章，通過廣譜PCR結(jié)合置換探針基因分型的方法實(shí)現(xiàn)食源性致病菌的廣譜檢測與識(shí)別。通過廣譜PCR擴(kuò)增食源性致病菌的16S rRNA和23S rRNA基因的保守區(qū)域，利用雙鏈置換探針-MCPC技術(shù)針對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的差異序列區(qū)分不同產(chǎn)物，實(shí)現(xiàn)了在單管中對(duì)9類常見食源性致病菌的識(shí)別。該方

4、法覆蓋常見的食源性致病菌，包括致病性大腸桿菌和志賀菌、沙門菌、單增李斯特菌、蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、霍亂弧菌、副溶血弧菌、變形桿菌和化膿性鏈球菌。對(duì)129株菌株的分型結(jié)果與已知的鑒定結(jié)果一致。 第四章，以特異基因作為靶標(biāo)，建立HAND系統(tǒng)結(jié)合改良分子信標(biāo)-MCPC技術(shù)的方法實(shí)現(xiàn)食源性致病菌的廣譜檢測與識(shí)別。以7種致病弧菌作為研究對(duì)象，通過HAND系統(tǒng)結(jié)合MCPC技術(shù)，在一個(gè)PCR管中實(shí)現(xiàn)了對(duì)O1群霍亂弧菌、O139群霍亂弧

5、菌、副溶血弧菌及其毒力株、溶藻弧菌、河弧菌、擬態(tài)弧菌和創(chuàng)傷弧菌任意一種模板的檢測。該方法具有靈敏度高(檢測靈敏度為2-100拷貝/反應(yīng))，特異性好，檢測通量高(一次能分辨7種靶序列的任意一種)，在寬泛的模板濃度范圍(至少6個(gè)數(shù)量級(jí))內(nèi)具有良好的定量能力(R2>0.99)。該方法通過了145株菌株的特異性驗(yàn)證，證明其結(jié)果可靠、準(zhǔn)確。 本論文利用多色實(shí)時(shí)PCR技術(shù)提供了針對(duì)食源性致病菌廣譜檢測與識(shí)別的三種解決方案，這些方法具有操作簡