1、第一部分主要miRNA在非創(chuàng)傷性股骨頭壞死患者和對照組患者骨髓基質(zhì)干細(xì)胞中的表達差異研究
　　目的:觀察非創(chuàng)傷性股骨頭壞死患者與骨性關(guān)節(jié)炎患者骨髓基質(zhì)干細(xì)胞中主要miRNA的表達差異，尋找在非創(chuàng)傷性股骨頭壞死發(fā)病過程中起重要調(diào)節(jié)作用的miRNA。
　　方法:大量查閱文獻后找到參與調(diào)節(jié)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成骨分化，成脂分化，增殖相關(guān)過程的主要備選miRNA10個，分別為：miR-20a，miR-17-5p，miR-27a-3p，mi

2、R-96-5p，miR-124-3p，miR-125b-5p，miR-133a，miR-143，miR-155-5p，miR-199a-5p。臨床上收集了20例非創(chuàng)傷性股骨頭壞死患者原代骨髓基質(zhì)干細(xì)胞以及10例對照組患者原代骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，使用實時熒光定量RT-PCR方法檢測上述10個miRNA的在實驗組及對照組中的表達。
　　結(jié)果:miR-20a，miR-17-5p，miR-27a-3p，miR-125b-5p，miR-133a

3、，miR-143，miR-155-5p，miR-199a-5p在實驗組表達較對照組顯著降低，有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05），miR-96-5p，miR-124-3p在對照組和實驗組間無明顯差異(p>0.05)。
　　結(jié)論:miR-20a，miR-17-5p，miR-27a-3p，miR-125b-5p，miR-133a，miR-143，miR-155-5p，miR-199a-5p可能通過靶向于不同的mRNA調(diào)節(jié)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的分化與

4、增殖，在非創(chuàng)傷性股骨頭壞死病理過程中起作用。
　　第二部分miR-17-5p調(diào)控SMAD7在HMSC-bm成骨分化過程中表達的研究
　　目的：miR-17-5p在非創(chuàng)傷性股骨頭壞死患者MSC中表達水平顯著低于對照組，本部分實驗?zāi)康脑谟谕ㄟ^生物信息學(xué)預(yù)測與熒光素酶報告基因檢測找到并確定miR-17-5p的靶基因，并檢測其在非創(chuàng)傷性股骨頭壞死患者MSC標(biāo)本中的表達水平以及在HMSC-bm成骨分化過程中的表達水平變化規(guī)律。

5、　　方法：使用TargetScan6.2與Pictar網(wǎng)站進行miR-17-5p靶基因預(yù)測。實時定量PCR檢測第一部分中20個非創(chuàng)傷性股骨頭壞死患者MSC標(biāo)本中SMAD7表達水平，以及其與miR-17-5p表達水平是否具有相關(guān)性。實時定量PCR檢測BMP-2誘導(dǎo)的HMSC-bm成骨分化過程中第0,1,2,4,6天miR-17-5p及SMAD7表達水平變化趨勢（與不加入BMP-2的對照組進行比較）。在HMSC-bm細(xì)胞中使用miR-17-

6、5p類似物與miR-17-5p抑制劑調(diào)整miR-17-5p表達水平，實時定量PCR檢測SMAD7表達水平，Western蛋白印跡試驗檢測Smad7濃度。采用熒光素酶報告基因檢測方法，檢測miR-17-5p與SMDA7是否具有調(diào)控關(guān)系。
　　結(jié)果： SMAD7通過生物信息學(xué)預(yù)測可能是miR-17-5p的靶基因，結(jié)合SMAD7的生理作用我們認(rèn)為miR-17-5p可能通過靶向抑制SMAD7在非創(chuàng)傷性股骨頭壞死病理過程中起調(diào)控作用。Rea

7、l-time PCR結(jié)果顯示在非創(chuàng)傷性股骨頭壞死患者MSC標(biāo)本中miR-17-5p與SMAD7表達水平呈負(fù)相關(guān)（R2=0.5440，p=0.0002）。在BMP-2誘導(dǎo)的HMSC-bm成骨分化過程中miR-17-5p的表達水平自誘導(dǎo)后第一天起顯著高于對照組（p<0.05），SMAD7的表達水平自誘導(dǎo)后第二天起顯著低于對照組（p<0.05）。miR-17-5p類似物組SMAD7表達水平與Smad7蛋白濃度顯著高于陰性對照組，miR-17-

8、5p抑制劑組SMAD7表達水平與Smad7蛋白濃度顯著低于陰性對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）。熒光素酶報告基因檢測示miR-17-5p通過靶向抑制SMAD7下調(diào)其表達。結(jié)論： miR-17-5p通過不完全互補結(jié)合SMAD7的3’UTR端靶向抑制其表達，在非創(chuàng)傷性股骨頭壞死發(fā)病過程及MSC成骨分化過程中發(fā)揮調(diào)控作用。
　　第三部分miR-17-5p促進HMSC-bm細(xì)胞增殖及成骨分化的機制研究
　　目的：研究miR

9、-17-5p提高HMSC-bm細(xì)胞系增殖與成骨分化的機制。
　　方法：在HMSC-bm細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-17-5p類似物與miR-17-5p抑制劑調(diào)整miR-17-5p表達水平并設(shè)立陰性對照，轉(zhuǎn)染4小時后加入100ng/ml BMP-2進行成骨誘導(dǎo)。6天后實時定量PCR觀察RUNX2以及Ⅰ型膠原表達水平改變，通過ALP染色觀察HMSC-bm細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶表達強度，通過CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞增殖的改變。為了證明HMSC-bm細(xì)胞

10、增殖及成骨分化增強是通過SMAD7表達水平下降而導(dǎo)致的，我們通過轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-SMAD7人為提高SMAD7表達水平，觀察以上效應(yīng)是否減弱及逆轉(zhuǎn)。
　　結(jié)果：在BMP-2誘導(dǎo)的HMSC-bm成骨分化過程中，轉(zhuǎn)染miR-17-5p類似物組RUNX2，COL1A1的表達水平顯著高于陰性對照組（p<0.05），堿性磷酸酶表達顯著高于對照組，細(xì)胞增殖顯著高于對照組（p<0.05）。轉(zhuǎn)染miR-17-5p抑制劑組RUNX2，Ⅰ型膠原的