1、背景及目的:
　　膿毒癥(sepsis)是嚴(yán)重感染、休克、燒傷等重癥感染患者常見的并發(fā)癥，可進(jìn)一步發(fā)展成為多器官功能衰竭（multipleorgandysfunctionsyndrome，MODS），其發(fā)病迅速，病死率高。目前對(duì)于膿毒癥的發(fā)病機(jī)制已逐漸有一致的看法，即全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemicinflammatoryresponsesyndrome，SIRS)是形成膿毒癥及多器官功能衰竭重要的病理學(xué)基礎(chǔ)和形成的根本原因。

2、
　　MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路存在于大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)，其中的p38(38kDaprotein)絲裂原活化蛋白激酶(mitogenactivatedproteinkinase，MAPK)為細(xì)胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白酶激酶，是介導(dǎo)細(xì)胞反應(yīng)的重要信號(hào)系統(tǒng)，在炎癥反應(yīng)中起著十分重要的作用。在SIRS中產(chǎn)生的炎癥因子眾多，其中TNF-α是最重要的炎癥介質(zhì)。相關(guān)報(bào)告中指出原花青素在內(nèi)毒素刺激的單核-巨噬細(xì)胞中作為抗炎劑，其抗炎機(jī)制可能是通過對(duì)核轉(zhuǎn)

3、錄因子轉(zhuǎn)化的抑制作用來(lái)調(diào)節(jié)激活的單核巨噬細(xì)胞的免疫應(yīng)答，從而發(fā)揮抗炎的效應(yīng)。
　　本文通過LPS誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞構(gòu)造膿毒癥體外模型，揭示原花青素對(duì)膿毒癥細(xì)胞模型具有顯著的保護(hù)作用，且在較大的藥物濃度范圍內(nèi)無(wú)毒副作用。證實(shí)原花青素能夠抑制TNF-α等炎性因子的釋放，探討原花青素抑制TNF-α的釋放與p38MAPK通路的關(guān)系。
　　方法:
　　將人THP-1細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)（37℃、5％CO2的孵箱內(nèi)），至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，

4、加入LPS1ug/ml制造膿毒癥模型。首先利用細(xì)胞藥物毒性實(shí)驗(yàn)(CCK-8)，一是研究原花青素對(duì)THP-1細(xì)胞增殖活性是否有影響。二是選取藥物作用的三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，即6h，12h，24h，在各時(shí)間點(diǎn)下依據(jù)不同的藥物濃度進(jìn)行分組，研究原花青素對(duì)LPS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞生存率的影響，從而選擇藥物作用較適宜的時(shí)間及藥物濃度;其次利用ELISA檢測(cè)不同藥物濃度下TNF-α的相對(duì)蛋白濃度，選擇原花青素最佳的藥物作用濃度。最后，利用Westernbl

5、otting測(cè)p38及NF-κB蛋白的表達(dá)量，揭示原花青素抑制TNF-α的釋放與p38MAPK通路的關(guān)系。
　　結(jié)果:
　　1、利用CKK-8試劑盒對(duì)細(xì)胞增殖的活性進(jìn)行測(cè)定，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)450nm處測(cè)定吸光度值，用各組細(xì)胞活力值(％)表示。與對(duì)照組相比，不同的原花青素濃度下變化不明顯，對(duì)THP-1細(xì)胞增殖活力的影響沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　2、(1)利用CCK-8試劑盒對(duì)各組細(xì)胞生存率進(jìn)行測(cè)定，用細(xì)胞活

6、力值(％)表示。于6h，12h，24h這三個(gè)不同的藥物作用時(shí)間點(diǎn)下，LPS+不同濃度藥物組的細(xì)胞活力均低于對(duì)照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　(2)不同的藥物作用時(shí)間點(diǎn)下，隨著原花青素濃度的不斷增加，各組細(xì)胞生存率均呈現(xiàn)出先降低后逐漸上升的趨勢(shì)，當(dāng)原花青素的藥物濃度于100ug/ml時(shí)細(xì)胞生存率再次下降。故為節(jié)約資源及簡(jiǎn)化操作，本實(shí)驗(yàn)將采12h組50ug/ml和100ug/ml兩個(gè)藥物濃度進(jìn)行下一步研究。
　　3、(

7、1)ELISA法檢測(cè)不同藥物濃度組細(xì)胞上清液中TNF-α的相對(duì)蛋白濃度，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組THP-1細(xì)胞TNF-α的相對(duì)蛋白濃度差異明顯(P＜0.05);
　　(2)單純LPS組釋放TNF-α的相對(duì)蛋白濃度最高，50ug/ml和100ug/ml兩原花青素處理組TNF-α的相對(duì)蛋白濃度低于單純LPS誘導(dǎo)組(P＜0.05)，說明兩種濃度作用下的原花青素均能很好的降低經(jīng)LPS誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞釋放TNF-α的量;
　　(3)5

8、0ug/ml和100ug/ml兩濃度原花青素處理組進(jìn)行組間比較，100ug/ml濃度組對(duì)TNF-α的抑制效果更為明顯(P＜0.05)，故選定該濃度用于蛋白水平的研究。
　　4、(1)利用Westernblotting檢測(cè)原花青素對(duì)LPS刺激的p38蛋白的表達(dá)，不同處理組與空白對(duì)照組P-p38相對(duì)表達(dá)量存在顯著差異(P＜0.05)。LPS組P-p38相對(duì)表達(dá)量最高，原花青素處理組的表達(dá)量最低。
　　(2)利用Westernbl

9、otting檢測(cè)NF-κB蛋白的表達(dá)，對(duì)不同組的蛋白相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)不同處理組與空白對(duì)照組的結(jié)果存在顯著差異(P＜0.05)。LPS組THP-1細(xì)胞的NF-κB相對(duì)表達(dá)量最高，原花青素處理組的NF-KB相對(duì)表達(dá)量最低。該蛋白表達(dá)量在不同處理組的差異趨勢(shì)與P-p38的Westernblotting檢測(cè)結(jié)果基本一致。
　　結(jié)論:
　　1、膿毒癥是感染因素造成的全身炎癥反應(yīng)，細(xì)菌感染是膿毒癥發(fā)病的主要原因，其中革蘭氏陰性菌