1、目的:
　　觀察原花青素對白細胞介素-1beta（interleukin-lbeta，IL-1β）誘導的軟骨細胞凋亡的影響，從而探討原花青素在保護軟骨細胞方面的作用。
　　方法:
　　1.在無菌的環(huán)境下取6周齡昆明小鼠膝關(guān)節(jié)處軟骨組織，剪碎成泥，用0.2％的Ⅱ型膠原酶消化6小時至軟骨組織基本消失，消化完成后，用200目鋼網(wǎng)過濾，離心后重懸至含有10％胎牛血清的細胞培養(yǎng)液中。接種于60mm培養(yǎng)皿中，然后放于37℃，5％C

2、O2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　2.取原代軟骨細胞鋪板，當細胞貼壁并且基本長滿后，用原花青素終濃度為0、0.001、0.005、0.010、0.050、0.100、0.500、1.000、5.000mg/ml每孔,IL-1β終濃度為10μ g/L的無血清細胞培養(yǎng)液分別培養(yǎng)軟骨24小時，然后采用MTT法用酶標儀檢測細胞存活率，并且獲得原花青素的最適藥物濃度。
　　3.取原代軟骨細胞鋪板，當細胞貼壁并且基本長滿后，將細胞分為三組。

3、溶劑對照組不加藥只加無血清培養(yǎng)液，凋亡組加入IL-1β終濃度為10μg/L的無血清細胞培養(yǎng)液，給藥組加入IL-1β終濃度為10μg/L和原花青素終濃度為0.050mg/ml（MTT法測出）的無血清培養(yǎng)液，24小時后加載熒光探針DCFH-DA用酶標儀檢測細胞內(nèi)活性氧自由基的含量。
　　4.取第一代軟骨細胞分三組，溶劑對照組不加藥只加無血清培養(yǎng)液，凋亡組加入IL-1β終濃度為10μg/L的無血清細胞培養(yǎng)液，給藥組加入IL-1β終濃度為

4、10μg/L和原花青素終濃度為0.050mg/ml的無血清培養(yǎng)液。孵育24小時之后，加載JC-1探針，用酶標儀檢測線粒體膜電位。
　　5.取第一代軟骨細胞，分為三組，溶劑對照組不加藥只加無血清培養(yǎng)液，凋亡組加入IL-1β終濃度為10μg/L的無血清細胞培養(yǎng)液，給藥組加入IL-1β終濃度為10μg/L和原花青素終濃度為0.050mg/ml的無血清培養(yǎng)液。24小時之后，去除上清液，加入胰酶消化細胞，用Binding Buffer重懸細

5、胞，加入Annexin V-FITC和PI后，用流式細胞儀檢測軟骨細胞的凋亡率。
　　6.取第一代軟骨細胞，分為三組，溶劑對照組不加藥只加無血清培養(yǎng)液，凋亡組加入IL-1β終濃度為10μg/L的無血清細胞培養(yǎng)液，給藥組加入IL-1β終濃度為10μg/L和原花青素終濃度為0.050mg/ml的無血清培養(yǎng)液。。24小時之后，去除上清液，加入胰酶消化細胞，用無血清細胞培養(yǎng)液洗細胞兩次，2000r/min5分鐘離心沉淀細胞，加戊二醛固定，

6、送至大連醫(yī)科大學電鏡室做超薄切片并用電子顯微鏡觀察。
　　結(jié)果:
　　1.在倒置相差顯微鏡下觀察，軟骨細胞在剛剛接種的時候成透明的圓形。1-2天之后貼壁，軟骨的形態(tài)為三角形、多邊形或者不規(guī)則型。當軟骨細胞成片生長時，呈現(xiàn)的形態(tài)為“鋪路石樣”。
　　2.MTT實驗結(jié)果顯示，原花青素對IL-1β介導的軟骨細胞凋亡有一定的抑制作用，在藥物濃度為0.005mg/ml，0.010mg/ml，0.050mg/ml，0.100mg/

7、ml，0.500mg/ml，1.000mg/ml的時候差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，其中，在原花青素濃度達到0.050mg/ml的時候細胞存活率達到最大值，切與濃度為0.010mg/ml、0.100mg/ml的時候相比差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。0.050mg/ml被選用成為接下來的實驗中所加入的原花青素的藥物濃度。
　　3.在利用熒光探針DCFH-DA進行的實驗中，實驗結(jié)果顯示，IL-1β作用于原代提取的軟骨細胞會使

8、細胞內(nèi)的活性氧自由基的水平升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。而原花青素對IL-1β誘導的軟骨細胞內(nèi)的ROS水平有一定的降低作用，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　4.在利用JC-1探針的實驗中，檢測結(jié)果顯示，凋亡組與溶劑對照組相比，綠色熒光強度與紅色熒光強度的比值明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。給藥組與凋亡組相比，綠色熒光強度與紅色熒光強度的比值明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　5.A

9、nnexin V-FITC/PI實驗流式細胞儀結(jié)果顯示凋亡組細胞的早期凋亡率和晚期凋亡率相對于溶劑對照組均明顯升高(P＜0.05);給藥組細胞的早期凋亡率相對于凋亡組明顯降低(P＜0.05)，晚期凋亡率相對于凋亡組降低(P＞0.05)。
　　6.電子顯微鏡的觀察顯示在溶劑對照組中軟骨細胞細胞增殖活躍，細胞形態(tài)正常。在凋亡組中細胞呈凋亡狀態(tài)。在給藥組中軟骨細胞凋亡狀態(tài)有所緩和。
　　結(jié)論:
　　原花青素能夠抑制IL-1β