1、前言：水通道蛋白1(Aquaporin1,AQP-1)是一類(lèi)跨膜通道蛋白家族的一員,具有特異雙向水通透性。在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)水腫中,AQP-1可能參與軟骨細(xì)胞體積和水平衡的調(diào)節(jié)。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)AQP-1在正常椎間盤(pán)髓核(Nucleus Pulposus,NP)表達(dá),但未見(jiàn)其在老化退變NP的表達(dá)及可能功能的報(bào)道。細(xì)胞外環(huán)境發(fā)生不同改變時(shí),細(xì)胞需重構(gòu)細(xì)胞外基質(zhì)來(lái)維持組織結(jié)構(gòu)的穩(wěn)態(tài)。椎間盤(pán)細(xì)胞,尤其是NP細(xì)胞處于一獨(dú)特的細(xì)胞外環(huán)境中:低氧,酸性

2、和持續(xù)高應(yīng)力、高滲透壓狀態(tài)。在老化退變的椎間盤(pán)內(nèi),細(xì)胞外基質(zhì)及外環(huán)境變化,細(xì)胞必須通過(guò)不同機(jī)制,如:主動(dòng)的質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn),維持椎間盤(pán)的穩(wěn)態(tài)。研究表明NP細(xì)胞在不同細(xì)胞外環(huán)境改變時(shí),其形態(tài)、功能發(fā)生顯著變化,但確切機(jī)制不明確。AQP-1可能通過(guò)主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)小而關(guān)鍵的分子影響細(xì)胞與外環(huán)境的交互作用。那么髓核細(xì)胞在滲透壓、氧分壓變化下發(fā)生什么樣的功能改變,AQP-1對(duì)NP細(xì)胞適應(yīng)這些變化能發(fā)揮什么樣的功能呢?
　　 目的：本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定AQP-

3、1在老化退變腰椎NP中的表達(dá),初步探討其在老化退變NP的可能功能;通過(guò)觀察在不同滲透壓、氧分壓下NP細(xì)胞表達(dá)AOP-1的差異,初步探討NP細(xì)胞在滲透壓、氧分壓改變時(shí)的反應(yīng)以及AQP-1可能對(duì)NP細(xì)胞在適應(yīng)滲透壓、氧分壓變化時(shí)發(fā)揮的作用。
　　 方法：
　　 1、HE和免疫組化12只日本大白兔按年齡(0.5歲青年,1歲成年,3歲老年)分3組(n=4)。每組1只兔腰椎準(zhǔn)備HE和免疫組化染色。每組另3只兔用于免疫印跡分析。HE

4、和免疫組化染色按常規(guī)步驟進(jìn)行。所有結(jié)果在顯微鏡下觀察數(shù)碼相機(jī)取相。
　　 2、細(xì)胞培養(yǎng)6只成年兔用于NP細(xì)胞培養(yǎng),一部分細(xì)胞種植于蓋玻片上用于HE和免疫組化染色。在不同條件下培養(yǎng)后,一部分細(xì)胞測(cè)定活性率,其余細(xì)胞置于液氮中凍存,準(zhǔn)備總RNA提取。
　　 3、細(xì)胞活性率將用于細(xì)胞活性率計(jì)數(shù)的細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液,稀釋。將細(xì)胞懸液與臺(tái)盼藍(lán)溶液混勻后,短時(shí)間內(nèi)分別計(jì)數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞,計(jì)算細(xì)胞活性率。
　　 4、免疫印跡

5、分析每組3只動(dòng)物腰椎NP組織快速取出后凍存。免疫印跡分析檢測(cè)在不同年齡NP組織中,AQP-1和2型膠原的表達(dá)差異。
　　 5、實(shí)時(shí)定量PCR用于檢測(cè)NP細(xì)胞關(guān)鍵蛋白和AQP-1在不同培養(yǎng)條件下的表達(dá)差異。
　　 結(jié)果：
　　 1、HE和免疫組化在青年和成年動(dòng)物NP內(nèi),軟骨樣細(xì)胞聚集成簇,其間可見(jiàn)散在小的脊索細(xì)胞。老年NP內(nèi)細(xì)胞數(shù)量明顯下降,脊索細(xì)胞消失,軟骨樣細(xì)胞肥大。軟骨樣細(xì)胞和脊索細(xì)胞均表達(dá)AQP-1陽(yáng)性。體

6、外培養(yǎng)的NP細(xì)胞表現(xiàn)異型性,AQP-1和2型膠原表達(dá)陽(yáng)性。
　　 2、細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞活性率在單層培養(yǎng)早期,細(xì)胞堆積成島狀,細(xì)胞多角,有大的突起,泡狀胞質(zhì)。一段時(shí)間后細(xì)胞增生為放射狀。細(xì)胞融合層疊,細(xì)胞核清晰。細(xì)胞活性率統(tǒng)計(jì)分析顯示在不同培養(yǎng)條件下,NP細(xì)胞活性無(wú)差異。
　　 3、免疫印跡2型膠原在成年和老年動(dòng)物中的表達(dá)逐級(jí)顯著下降。AQP-1在成年和老年動(dòng)物中均下降,以在成年動(dòng)物中下降最多。
　　 4、實(shí)時(shí)定量P

7、CR在滲透壓下降時(shí)AQP-1表達(dá)明顯下調(diào),在氧分壓下降時(shí),AQP-1表達(dá)明顯上調(diào),而在兩者均下降時(shí),AQP-1表達(dá)呈上升趨勢(shì)。在滲透壓/氧分壓短期快速下降時(shí),細(xì)胞功能受顯著影響,aggrecan和2型膠原表達(dá)顯著下降,滲透壓和氧分壓均下降時(shí),兩者下降更為明顯。
　　 討論：
　　 Sowa等研究發(fā)現(xiàn)隨年齡增加,兔腰椎間盤(pán)髓核發(fā)生退行性改變。Xia等研究發(fā)現(xiàn),在退變的椎間盤(pán)髓核中,2型膠原的表達(dá)隨著退變嚴(yán)重程度增加而逐漸下

8、降。這些與本實(shí)驗(yàn)在不同年齡的兔腰椎間盤(pán)中觀察到的結(jié)果相似。
　　 椎間盤(pán)老化退變降低NP細(xì)胞外滲透壓。NP細(xì)胞腫脹變形,可能通過(guò)主動(dòng)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制以對(duì)抗之。研究表明AQP-1被阻斷或抑制后,可以顯著增加細(xì)胞調(diào)節(jié)性體積下降,減少體積腫脹變形。在成年和老年動(dòng)物髓核中,AQP-1均顯著下降。說(shuō)明滲透壓下降時(shí),NP細(xì)胞可能通過(guò)降低水的通透性,減少體積增加。在老年動(dòng)物髓核中,AQP-1有所增加,說(shuō)明存在其他因素影響AQP-1表達(dá),作用與滲透

9、壓相反。
　　 正常NP細(xì)胞處于低氧環(huán)境。當(dāng)椎間盤(pán)退變時(shí),其氧分壓進(jìn)一步降低,嚴(yán)重影響細(xì)胞功能。細(xì)胞可能通過(guò)獲得02改善功能。研究表明AQP-1具有O2通透性,可能輔助細(xì)胞獲得更多的O2。因此,在氧分壓降低時(shí)NP細(xì)胞可能通過(guò)增加AQP-1表達(dá)以獲得O2,減少低氧帶來(lái)的傷害。機(jī)械應(yīng)力是影響椎間盤(pán)退變的另一重要因素。隨著椎間盤(pán)老化退變的發(fā)展,應(yīng)力對(duì)細(xì)胞的傷害逐漸加重。Baetz等發(fā)現(xiàn)在AQP-1過(guò)表達(dá)情況下,細(xì)胞對(duì)抗應(yīng)力傷害的能力增

10、加。因此,在老年動(dòng)物,NP細(xì)胞可能通過(guò)增加AQP-1的表達(dá),來(lái)抵抗機(jī)械應(yīng)力的傷害。
　　 Fischbarg等發(fā)現(xiàn)敲除AQP-1后,細(xì)胞表現(xiàn)顯著的調(diào)節(jié)性體積下降(僅為對(duì)照的60％)。而當(dāng)AQP-1被HgCl2或siRNA抑制后,細(xì)胞快速體積變化明顯降低。另外NP細(xì)胞可通過(guò)激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶來(lái)適應(yīng)滲透壓下降。該激酶可以降低AOP-1表達(dá)。因此,滲透壓降低時(shí),NP細(xì)胞可能通過(guò)降低AQP-1表達(dá)調(diào)控水在細(xì)胞內(nèi)外分布以減少細(xì)胞體積增

11、加,進(jìn)而維持主要功能和活性。氧分壓降低時(shí),NP細(xì)胞代謝下降。說(shuō)明NP細(xì)胞需要O2參與代謝,然而其獲得O2的途徑尚不明確。研究表明AQP-1具有O2通透性,并可能輔助細(xì)胞獲得更多的02。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在氧分壓降低時(shí),NP細(xì)胞表達(dá)AQP-1增加,說(shuō)明NP細(xì)胞可能通過(guò)AQP-1獲得O2以對(duì)抗低氧分壓帶來(lái)的傷害。而當(dāng)滲透壓和氧分壓同時(shí)下降時(shí),NPC表達(dá)AQP-1為上升趨勢(shì),說(shuō)明可能存在兩種不同的,互相矛盾的調(diào)控機(jī)制影響AQP-1的表達(dá),NP

12、細(xì)胞可能對(duì)氧分壓下降更敏感,會(huì)傾向于對(duì)自己更有利的一面調(diào)節(jié)結(jié)論AQP-1在不同年齡段兔腰椎NP組織中表達(dá)不同,反映AQP-1可能參與老化退變椎間盤(pán)NP細(xì)胞與外環(huán)境的交互作用。滲透壓和氧分壓是NP細(xì)胞外環(huán)境的重要組成因素,其改變顯著影響NP細(xì)胞功能,但未影響細(xì)胞活性。AQP-1具有水和O2通透性,能調(diào)節(jié)細(xì)胞體積和幫助細(xì)胞獲得O2。NP細(xì)胞在不同滲透壓和氧分壓下表達(dá)AQP-1不同,提示AQP-1可能參與調(diào)節(jié)NP細(xì)胞適應(yīng)滲透壓、氧分壓下降的變