1、幽門(mén)螺桿菌(H.pylori)是慢性胃炎和消化性潰瘍的重要病原菌,且與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)?，F(xiàn)已有許多研究致力于探討H.prlori致病相關(guān)的細(xì)菌、宿主和環(huán)境因素之間的交互作用。其中,鑒定病原菌的毒力株和毒力蛋白是微生物致病機(jī)理研究的基本策略。Enroth等采用2-DE和免疫印跡技術(shù)對(duì)來(lái)自胃炎、十二指腸潰瘍和胃癌患者的不同H.pylori臨床分離株進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究,結(jié)果提示不同類(lèi)型胃疾病的H.pylori菌株蛋白質(zhì)組中存在疾病特異性蛋白

2、。
　　 目前研究發(fā)現(xiàn),與H.pylori菌株致病性有關(guān)的基因位點(diǎn)主要為細(xì)胞毒素相關(guān)基因(CagA)及空泡毒素相關(guān)基因(VacA)等。國(guó)外報(bào)道,感染CagA陽(yáng)性或VacA多念性變異的H.pylori菌株可以提高胃癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。除了Caga,VacA外,近年來(lái)有學(xué)者陸續(xù)報(bào)道一些功能未知或尚未鑒定的菌株特異性基因位點(diǎn)也可能與H.pylori相關(guān)性胃疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。前期,該室通過(guò)抑制消減雜交(SSH)和斑點(diǎn)雜交的方法建立胃癌相關(guān)

3、幽門(mén)螺桿菌差異基因文庫(kù),對(duì)差異基因進(jìn)行篩選挑出11個(gè)與胃癌相關(guān)的高拷貝基因序列,證實(shí)了其中HPSH_05790在胃癌患者來(lái)源的菌株L301及淺表性胃炎患者來(lái)源的菌株B975的基因中存在拷貝差異。目前,該差異基因的具體功能尚不清楚。KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)報(bào)道其蛋白結(jié)構(gòu)域中包含peptidyl-prolyl cis-trans isomerase功能域,即肽基-脯氨酰-順?lè)串悩?gòu)酶(PPIase),其被證實(shí)在嗜肺軍團(tuán)菌中具有毒力因子特征。
　　

4、 本研究通過(guò)構(gòu)建胃癌相關(guān)差異基因幽門(mén)螺桿菌HPSH_05790真核表達(dá)質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)染3種胃細(xì)胞系A(chǔ)GS、SGC7901、GES-1觀察重組蛋白對(duì)細(xì)胞的增殖效應(yīng)和細(xì)胞周期的變化。為進(jìn)一步探索疾病相關(guān)H.pylori菌株的致病機(jī)制,尋找具有針對(duì)性的治療靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)工具和研究線索。
　　 材料和方法：
　　 一、細(xì)胞系、菌株和質(zhì)粒人胚腎AD293細(xì)胞系、胃腺癌AGS細(xì)胞系購(gòu)自ATCC。人胃上皮細(xì)胞株GES-1來(lái)自北京市腫瘤防治

5、研究所細(xì)胞遺傳室。人胃腺癌細(xì)胞系SGC-7901和H.pylori菌株及DNA來(lái)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所腫瘤病因與篩查研究室。DH5a感受態(tài)細(xì)菌購(gòu)自TaKaRa公司。pcDNATM3.1/myc-His(-)質(zhì)粒:由美國(guó)西弗吉尼亞大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理/藥理學(xué)系劉軍副教授贈(zèng)與。
　　 二、實(shí)驗(yàn)方法
　　 (一)HPSH_05790基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其表達(dá)產(chǎn)物的鑒定以胃癌及胃炎來(lái)源的幽門(mén)螺桿菌DNA為模板,根據(jù)差異基因HPS

6、H_05790序列和pcDNATM3.1/myc-His(-)載體多克隆酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及pcDNATM3.1/myc-His(-)同時(shí)用EcoRI、BamHI雙酶切連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH50α,篩選陽(yáng)性克隆,抽提質(zhì)粒去內(nèi)毒素并測(cè)序,與GeneBank中HPSH_05790序列比較同源性。并通過(guò)Western Blot方法對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。
　　 (二)細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染SGC-7901、GES-1、AD293和A

7、GS分別在含有20％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基,F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)中培養(yǎng)(37℃,5％CO2)。將各類(lèi)細(xì)胞接種在6孔板里,待細(xì)胞密度達(dá)到90％左右,用無(wú)血清的培養(yǎng)基饑餓2h后,分別轉(zhuǎn)染:以L301、26695菌株為模板構(gòu)建的HPSH_05790重組質(zhì)粒,以轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒,和未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為對(duì)照。轉(zhuǎn)染用試劑LipofectamineTM2000,具體操作步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。取各實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組細(xì)胞,進(jìn)行細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期檢測(cè)。

8、
　　 (三)細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期檢測(cè)
　　 1、CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力取轉(zhuǎn)染后的胃癌細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),分別接種于3個(gè)96孔板培養(yǎng)板。第24、48、72小時(shí)分別加入10ulCCK-8溶液,繼續(xù)37℃孵育2-4小時(shí)后選擇波長(zhǎng)450nm在酶聯(lián)免疫(ELlsA)檢測(cè)儀上測(cè)定各孔吸光度。
　　 2、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期變化收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制成5×105個(gè)/ml細(xì)胞懸液。1000rpm離心5min,棄上清。PB

9、S洗滌一次,棄上清,重新懸浮于75％冰乙醇中,4℃固定過(guò)夜、離心后制成400ul的細(xì)胞懸液,加碘化丙淀染液(PI)于37℃避光孵育30分鐘后,流式細(xì)胞儀檢測(cè),ModFitLT3.0軟件分析細(xì)胞周期。
　　 3、統(tǒng)計(jì)分析
　　 所有計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)描述,每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次,采用單因素方差分析。所有統(tǒng)計(jì)分析均采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件完成,以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：

10、>　　 1、胃癌相關(guān)差異基因HPSH_05790基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其表達(dá)產(chǎn)物的鑒定目的基因PCR、重組質(zhì)粒EcoRI/BamHI雙酶切電泳鑒定,產(chǎn)物為560bpDNA片段,與理論片段大小一致。DNA測(cè)序結(jié)果表明融合區(qū)域的讀碼框正確。Blast比對(duì)序列同源性好。體外轉(zhuǎn)染AD293細(xì)胞48h Western Blot結(jié)果證實(shí)該蛋白可以正常表達(dá)。
　　 2、HPSH_05790重組子瞬時(shí)轉(zhuǎn)染3種不同胃細(xì)胞系,觀察其增殖作用和細(xì)

11、胞周期變化情況CCK-8法比較重組蛋白對(duì)3個(gè)胃細(xì)胞系A(chǔ)GS、SGC7901、GES-1增殖作用的影響,發(fā)現(xiàn)在兩個(gè)胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS、SGC7901中,細(xì)胞較正常胃粘膜上皮細(xì)胞系有增殖趨勢(shì),尤其是AGS細(xì)胞系,但均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。觀察3種細(xì)胞系瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞周期變化,發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)染效率較高的AGS細(xì)胞系,兩重組蛋白組S期(％)26.927(±2.445),25.683(±2.83)較其他組21.227(±0.813),21.243(±1.71)