1、前言：急性肺損傷(ALI)被認為是急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)的早期表現(xiàn)，其發(fā)病機制至今尚不完全清楚，臨床預后較差，死亡率較高。ALI發(fā)展過程中肺纖維增生可以通過增加呼吸膜的厚度進而影響早期氣血交換，減小肺順應性，影響預后。以往認為肺纖維化僅僅發(fā)生在ALL/ARDS的晚期，而近年研究表明在ALL/ARDS早期即有肺纖維增生改變。Ⅰ型前膠原羧基端肽(PICP)是膠原合成過程中的水解產物，可以反映Ⅰ型膠原的合成情況，本實驗通過檢測脂多糖(

2、LPS)致ALI大鼠血清及肺泡灌洗液(BALF)中PICP的含量，來檢測ALL/ARDS早期是否有肺纖維增生的存在；同時測定轉化生長因子β1(TGF-β1)含量，并研究其是否與膠原合成有相關關系。從而為ALI/ARDS早期肺纖維增生的存在及其發(fā)生機制的研究提供實驗依據(jù)，并為早期抗纖維化治療提供理論依據(jù)。 材料與方法一、材料1.實驗動物：SD(Sprague-Dawley)大鼠，雌雄不拘，共27只，體重275g±25g，飼養(yǎng)于潔凈

3、、溫控的動物中心實驗室，以避免肺部感染的發(fā)生，正常進食水，源于中國醫(yī)科大學動物中心。 2.主要試劑：脂多糖LPS：E.coli，內毒素055：B5LPS；購于Sigma.Co。大鼠血清及上清液PICP酶聯(lián)免疫吸附試劑盒：美國進口分裝；源于大連泛邦生物技術公司。TGF-β1一抗；SABC免疫組化試劑盒(包括正常血清封閉液，二抗：兔抗大鼠IgG，SABC，復合消化酶)；DAB顯色劑。源于武漢博士德生物工程有限公司。 3.主要

4、器材：低溫離心機：Hettich32R，源于德國。顯微圖象分析系統(tǒng)：MetaMorph/DP10/BX41，由UIC/OLYMPUS，US/JP生產。酶標儀：芬蘭雷博公司進口。 二、實驗方法1.實驗動物的分組及處理：將27只SD大鼠隨機分成3組：NS對照組、LPS1組、LPS2組，每組9只大鼠。NS對照組氣管內滴注生理鹽水1.0ml/kg，LPS1組及LPS2組氣管內滴注LPS1.0ml/kg(濃度為100μg/ml)。將滴注L

5、PS的大鼠隨機分成兩組，其中給藥后觀察12小時取材的為LPS1組，給藥后觀察24小時取材的為LPS2組。 2.肺損傷的評價：肺損傷嚴重程度可根據(jù)以下標準判定：(1)測定肺濕重/干重(W/D)比值：是判定肺水腫的主要指標。剪取一部分左肺組織稱濕重(W)，然后置于60℃溫箱中，7天后稱干重(D)，求得W/D。(2)BALF的細胞總、分數(shù)及白蛋白測定：右主支氣管進行肺泡灌洗，將回收的支氣管肺泡灌洗液(BALF)混合計量，離心后測上清液

6、白蛋白濃度，離心沉淀細胞利用4℃低溫離心機將細胞均勻平鋪于載波片上，HE染色后在40×高倍鏡下進行細胞分類計數(shù)。(3)觀察肺組織病理表現(xiàn)：取右肺置于10％甲醛溶液中固定12小時，制成蠟塊后制成8μm肺組織切片，用于Hematoxylin-eosin(HE)染色，觀察肺組織病理表現(xiàn)。 3.血清及肺泡灌洗液PICP濃度測定：PICP采用酶聯(lián)免疫吸附法測定，按照試劑盒說明書進行操作，根據(jù)血清樣品的OD值可在標準曲線上查出其濃度。

7、 4.TGFβ-1在肺組織中的表達TGFβ-1采用免疫組化法測定。切片厚4μm，用復合消化酶進行抗原修復；滴加一抗稀釋濃度為1：100，20-37℃孵浴2小時，同時以PBS代替一抗而其它條件相同做陰性對照。TGFβ1陽性判定：陽性細胞的胞膜或胞漿呈棕黃或棕黃色顆粒，每張切片取任意5個視野(×400)，采用顯微圖像分析系統(tǒng)分析每個視野圖像的光密度總值(OD)，求其平均值，根據(jù)該值的高低判定TGFβ1陽性率的高低，OD值越高，TGFβ1陽

8、性率越高。 三、統(tǒng)計學分析：結果以均數(shù)±標準差((x)±s)表示；采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行方差分析和直線相關分析，P＜0.05為差異有顯著性。 結果一、LPS致大鼠ALI評價1.肺組織的病理改變①NS對照組：肺組織大體無異常所見。光鏡可見肺泡結構完整，未見明顯病變。 ②LPS1組和LPS2組大體觀可見所有肺組織均有腫脹，背膜光亮，有部分可見被膜下出血點。光鏡可見肺內彌漫性炎癥細胞浸潤，以中性粒細胞為主，肺

9、泡腔內有紅細胞滲出，有局限性肺氣腫和肺不張，肺毛細血管擴張呈不規(guī)則形，LPS2組較LPS1組肺泡間隔明顯增厚，間質增生，有淋巴細胞、巨噬細胞及成纖維細胞浸潤更為明顯。 2.血清白蛋白及總蛋白、BALF中白蛋白含量；BALF的細胞計數(shù)對照組及各實驗組間血清白蛋白及總蛋白差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；BALF中白蛋白在損傷12小時濃度(1.119±0.029g/L)明顯高于對照組(0.306±0.019g/L)；在24小時濃度(

10、0.734±0.033g/L)有所降低，但仍高于對照組；三組間的差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。在BALF的細胞計數(shù)中，NS對照組以淋巴細胞及巨噬細胞為主，而LPS1組、LPS2組均以中性粒細胞為主。 3.肺組織濕重/干重(W/D)肺W/D表明：肺損傷12小時組動物(6.517±0.177)與對照組(4.660±0.213)相比W/D明顯升高(P＜0.05)，而24小時組(4.801±0.199)與對照組無差異(P＞0.0

11、5)，說明損傷12小時組肺水腫最明顯。 二、血清及BALF中PICP濃度血清及BALF中PICP濃度在損傷12小時(分別為13.959±4.304μg/L，6.920±2.502μg/L)與對照組(分別為12.380±3.590μg/L，6.899±1.986μg/L)比較無差異(P＞0.05)，而在損傷24小時其濃度(分別為64.752±11.966μg/L，35.256±3.324μg/L)顯著高于對照組，具有統(tǒng)計學意義(P

12、＜0.05)。 三、TGF-β1在肺組織中的表達TGF-β1在肺組織免疫組化染色圖象分析顯示在損傷12小時(45.157±29.443)及24小時組(140.081±21.854)TGF-β1在肺組織中灰度總值(A)明顯高于正常對照組(7.175±3.686)(P＜0.05)；在損傷24小時組TGF-β1在肺組織中灰度總值(A)明顯高于損傷12小時組(P＜0.05)。NS對照組TGFβ1在肺組織表達陰性；LPS1組TGFβ1在肺

13、泡巨噬細胞、氣道壁大量表達；LPS2組TGFβ1在肺泡巨噬細胞、氣道壁表達進一步增加。 四、血清及BALF中PICP濃度與肺組織TGF-β1表達相關分析1.在急性肺損傷24小時血清和BALF中PICP濃度與肺組織TGF-β1表達呈正相關。兩者的相關系數(shù)分別為R=0.838，R=0.801(自由度n'=7，P＜0.01)。 討論急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)和急性肺損傷(ALI)是以頑固性低氧血癥，呼吸頻數(shù)和呼吸窘迫為主要

14、表現(xiàn)的臨床綜合征，肺纖維化是直接或間接導致ALI/ARDS患者死亡的原因之一。ARDS的病理過程可以分為三個階段：滲出期、增生期、和纖維化期。以往認為纖維增生反應只發(fā)生在增生晚期及纖維化期。本研究結果顯示：LPS致大鼠ALI24小時血清及BALF中PICP濃度顯著增高，肺組織TGF-β1表達顯著增高，說明ALI/ARDS的早期有肺纖維化形成的傾向。 膠原合成是肺纖維增生的重要標志。膠原蛋白的合成過程中首先合成前膠原；前膠原的肽鏈

15、兩端均有一個附加肽，在細胞外液中內切酶作用下去除氨基及羧基端附加肽，生成膠原纖維，同時釋放可溶性的N-末端及C-末端前膠原肽。因此，測定可溶性N-末端及C末端前膠原肽，可以作為膠原合成的標志物。PICP為Ⅰ型前膠原羧基端肽?？梢苑从尝裥湍z原的合成情況。本實驗檢測了LPS致大鼠急性肺損傷不同時段血清及BALF中PICP的濃度，其結果顯示在LPS致大鼠急性肺損傷12小時組血清及BALF中PICP濃度無顯著增高，而在損傷24小時PICP濃度顯

16、著高于正常對照組，肺組織病理結果顯示24小時肺組織損傷程度比12小時肺損傷程度嚴重，說明：前膠原肽主要來自損傷的肺組織，損傷愈重PICP濃度增加愈明顯。這與ChesnuttAN、MarshallRP等學者研究結果相一致。 在近年肺纖維化發(fā)病機制的研究中，TGF-β1被認為是與肺纖維化形成密切相關的細胞因子之一。TGF-β1可以通過趨化成纖維細胞并刺激其生長和成熟，刺激成纖維細胞分泌細胞外基質(ECM)，如纖維連接蛋白、膠原和蛋白

17、多糖的表達等機制促進肺纖維化。近來研究發(fā)現(xiàn)，在肺損傷24小時內TGF-β1在誘導膠原基因表達方面扮演重要角色。本實驗研究表明，在肺損傷12小時及24小時TGF-β1均顯著高于對照組；TGF-β1表達與血清及BALF中PICP濃度在肺損傷24小時二者具有正相關性，提示TGF-β1可能是膠原增生的誘導劑，肺損傷早期在誘導膠原基因表達方面可能扮演著重要的角色。 結論1.LPS致大鼠ALI后24小時血清及BALF中PICP濃度顯著增高提