1、本論文磨合當(dāng)前所關(guān)注的有關(guān)深海微生物、生物能源、廢物綜合利用3個(gè)熱點(diǎn)問(wèn)題,采用熒光觀測(cè)和氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用等技術(shù),篩選深海油脂酵母,利用糖蜜發(fā)酵生產(chǎn)微生物油脂并初步探討將其轉(zhuǎn)化為柴油的工藝。本研究主要由國(guó)家海洋局基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(2010009)資助,于海洋三所國(guó)家海洋局海洋生物遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。主要結(jié)果如下:
　　 采用培養(yǎng)基添加尼羅紅后檢測(cè)菌落熒光情況(在紫外燈下)的方法對(duì)大洋DY115-19、DY115-20航次

2、分離獲得的385株酵母進(jìn)行產(chǎn)油菌株的初篩,總共獲得22株產(chǎn)油酵母,其中20株來(lái)自西太平洋暖池區(qū),2株來(lái)自東太平洋多金屬結(jié)合區(qū)。所得產(chǎn)油酵母經(jīng)葡萄糖搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)后,采用有機(jī)溶劑法進(jìn)行復(fù)篩,結(jié)果顯示除6株酵母外(油脂含量接近20％),其余16株均為高產(chǎn)油脂酵母(油脂含量29.3％-62.9％)。
　　 通過(guò)26SrDNA D1/D2區(qū)的序列分析方法對(duì)22株高產(chǎn)酵母菌株進(jìn)行分子鑒定,并結(jié)合早期鑒定結(jié)果,對(duì)總共110株產(chǎn)油及非產(chǎn)油酵母進(jìn)

3、行了統(tǒng)計(jì)。結(jié)果顯示不同種類酵母在深海中分布數(shù)量存在較大差異,在所有檢測(cè)到的15種酵母中,相對(duì)數(shù)目分布較多的為Candida parapsilosis,Debaryomyces hansenii、Rhodosporidium paludigenum、Candida tropicalis。而篩選到得產(chǎn)油酵母僅分布于6個(gè)種,其中出現(xiàn)比例最高的為Candida viswanathii,其次為Rhodosporidiumpaludigenum,表

4、明深海產(chǎn)油酵母種類與目前常見(jiàn)的產(chǎn)油酵母一致,但種類分布更加狹窄。
　　 考慮到油脂生產(chǎn)成本,尋找可利用廉價(jià)底物高產(chǎn)油脂的微生物具有深遠(yuǎn)的意義。本文分別選擇葡萄糖及廉價(jià)的糖蜜作為碳源,比較16株產(chǎn)油酵母在兩種培養(yǎng)基中產(chǎn)油性能差異,結(jié)果顯示所有酵母在葡萄糖培養(yǎng)基中具有穩(wěn)定的產(chǎn)油能力。而在糖蜜培養(yǎng)基中,雖然多數(shù)酵母菌株生長(zhǎng)旺盛,但油脂含量卻大幅度下降,除近平滑假絲酵母2A00015產(chǎn)油能力未發(fā)生太大變化外(油脂含量40.81％,油脂系

5、數(shù)10.93),其他酵母菌株油脂含量均低于30％。表明糖蜜中存在某種影響因素阻礙了大多數(shù)酵母油脂合成,而酵母2A00015可能存在特殊的油脂代謝途徑或產(chǎn)生特殊物質(zhì)可抵抗不良因素的影響,因此我們選擇該酵母作為后續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)的試驗(yàn)菌株。
　　 由于傳統(tǒng)有機(jī)溶劑法提取酵母油脂需要消耗大量時(shí)間及有機(jī)溶劑,而且還容易產(chǎn)生環(huán)境污染。因此,在優(yōu)化糖蜜培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件之前,建立了一套以產(chǎn)油酵母2A00015為試驗(yàn)菌株,利用尼羅紅特性快速測(cè)定油脂含

6、量的簡(jiǎn)便方法,該測(cè)定方法得到相對(duì)熒光強(qiáng)度與稱重法得到油脂含量呈正相關(guān)性(R2=0.9608)。以上述方法作為油脂檢測(cè)手段,并結(jié)合正交設(shè)計(jì)和單因子試驗(yàn)對(duì)2A00015酵母菌株的培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,最后確定培養(yǎng)基最佳氮源為硫酸銨,最優(yōu)培養(yǎng)基成份為糖蜜(總糖濃度)110 g/L,硫酸銨1.0 g/L,酵母粉0.8 g/L,磷酸二氫鉀0.5g/L,碳氮比為137:1,相對(duì)油脂合成而言,糖蜜的濃度影響最大,其次分別為硫酸銨和磷酸二氫鉀,酵母

7、粉的影響最小。最佳發(fā)酵條件包括,搖瓶裝液量50mL/250mL,接種量為10％,初始pH5.0,培養(yǎng)基鹽度30％,培養(yǎng)溫度27℃。另外,我們還考察Mg2+、Fe2+,Mn2+、Zn2+、Cu2+5種金屬離子對(duì)酵母油脂合成的影響,結(jié)果顯示除Cu2+外,其他4種金屬離子在一定濃度下均可提高油脂含量。經(jīng)過(guò)上述優(yōu)化后得到菌體生物量和油脂產(chǎn)量分別為15.28 g/L、8.74 g/L,與未優(yōu)化前比較,生物量提高35.94％,油脂產(chǎn)量提高90.4％

8、。
　　 本文還對(duì)酵母油脂提取工藝及生物柴油制備方法進(jìn)行初步探索,確定了凍融-酸熱法(少量樣品)和高壓均質(zhì)機(jī)法(大量樣品)為最佳細(xì)胞破碎方法,乙醚-石油醚(2:1)混合液為最佳有機(jī)溶劑提取液。并在離子液體催化酯交換反應(yīng)制備生物柴油過(guò)程中,對(duì)醇油比、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、催化劑使用量進(jìn)行了優(yōu)化。所得生物柴油經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜(GC/MS)測(cè)定,其主要成分為:亞油酸甲酯40.98％,油酸甲酯32.18％,硬脂肪酸甲酯16.07％,棕櫚酸