1、研究背景和目的:血栓閉塞性脈管炎(Thromboangiitis obliterans, TAO)是以中小動靜脈節(jié)段性非化膿性炎癥和動脈腔內(nèi)血栓形成為特征的慢性閉塞性疾病。病變主要累及四肢遠端的中、小動脈,最終肢端發(fā)生壞疽、潰瘍。其病因至今尚未完全清楚。中、西醫(yī)均認為該病與血管內(nèi)皮細胞(Vascular endothelial cell, VEC)的損傷有密切關系。過度氧化是引起VEC凋亡的主要因素之一,損傷后的VEC形態(tài)及功能均發(fā)生改

2、變,是促進TAO血管內(nèi)血栓形成的重要原因。參附注射液(Shenfu injection,SFI)是中醫(yī)―回陽救逆‖古方—參附湯經(jīng)分離提取,滅菌制成。其主要成分是人參皂苷及烏頭中有效成分水溶性生物堿。我們前期研究發(fā)現(xiàn)SFI可能通過其加強對血小板聚集的抑制作用,提高血管的抗血栓功能,減少 TAO模型大鼠血栓形成,以及改善其病變體征。本實驗擬制作 H2O2氧化應激誘導VEC損傷模型,從離體細胞分子水平探討SFI對VEC損傷保護作用及其機制。<

3、br>　　1.體外培養(yǎng)人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞株(ECV304),采用免疫化學染色及免疫熒光染色法進行鑒定。
　　2.以5,10,20,30,40,80,160μ l/ml SFI與VEC分別孵育1.5h,3h,6h,12h,24h,48h,在確定的時間點采用MTT法檢測細胞存活率和倒置顯微鏡下進行形態(tài)學觀察,確定SFI對VEC作用的合適濃度和時間;同此方法檢測50,100,200,300,400,800μ mol/L H2O2與VE

4、C孵育3h、6h、12h、24h后細胞存活率和細胞形態(tài)學改變,確定H2O2氧化應激誘導VEC損傷的合適濃度和時間。
　　3.根據(jù)上述預實驗結果進行實驗分組:(1)對照組;(2) H2O2模型組(H2O2終濃度為300μmol/L);(3) SFI低劑量組(20μl/ml SFI+300μmol/L H2O2);(4) SFI中劑量組(30μl/ml SFI+300μmol/L H2O2);(5) SFI高劑量組(40μl/ml S

5、FI+300μmol/L H2O2)。VEC傳代培養(yǎng)至24h后,對照組及H2O2組加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3h,而低、中和高劑量 SFI預處理組分別加入20μl/ml、30μl/ml和40μl/ml SFI孵育3h,然后對照組換PBS、H2O2模型組及SFI處理組均換300μmol/L H2O2繼續(xù)培養(yǎng)3h。光學顯微鏡下檢查各實驗組VEC形態(tài)學損傷情況,MTT法檢測細胞存活率;比色法檢測各實驗組細胞SOD、GSH-PX活力及 MDA含量

6、;流式細胞技術及AO/EB雙染法檢測VEC細胞凋亡情況;western-blot法檢測各組細胞 Bcl2、Bax、Caspase-3蛋白表達情況;放射免疫法檢測各組細胞上清液TXB2、6-K-PGF1α含量;RT-qPCR檢測各組細胞TXAS的mRNA表達水平。
　　結果:
　　1.免疫化學染色及免疫熒光染色法鑒定結果顯示:95％以上的細胞胞漿內(nèi)可見陽性棕黃色顆粒及綠色熒光顆粒,證實所培養(yǎng)的細胞為VEC。
　　2.(1

7、)各濃度 SFI(5,10,20,30,40μ l/ml)分別與 VEC共同孵育一定時間(1.5h,3h,6h,12h,24h,48h)對VEC無損傷作用(P>0.05);80,160μ l/ml SFI可導致VEC細胞形態(tài)呈現(xiàn)明顯損傷性改變(P<0.05,P<0.01)。20,30,40μ l/ml SFI孵育3h對VEC影響較小且接近SFI臨床應用,是符合本實驗的合適濃度及時間。(2)各濃度H2O2(50,100,200,300,4

8、00,800μ mol/L)在不同時間段(3h、6h、12h、24h)均可引起VEC不同程度的細胞形態(tài)損傷性改變,且存在劑量時間依賴關系。300μ mol/L H2O2作用3h時細胞抑制率為50%左右(P<0.01),是合適的造模條件。
　　3.(1)H2O2模型組 VEC細胞形態(tài)學發(fā)生明顯損傷性改變,其存活率較對照組明顯降低(P<0.01);低、中和高劑量SFI均明顯抑制H2O2氧化應激誘導損傷的VEC形態(tài)學改變、提高VEC的存

9、活率(P<0.05,P<0.01)。(2)H2O2模型組SOD和GSH-PX活性較對照組明顯降低,MDA含量明顯升高(P<0.01)。與H2O2模型組相比,低、中和高劑量SFI組VEC細胞的SOD和GSH-PX活力明顯增加,MDA含量明顯降低(P<0.05,P<0.01)。
　　4.(1)流式細胞技術檢測發(fā)現(xiàn),H2O2模型組 VEC細胞凋亡率為55.4%±1.28%,明顯高于對照組的9.6%±0.401(P<0.01),低、中和高

10、劑量SFI預處理使VEC細胞凋亡率分別下降為47.5%±0.654、41.8%±0.734、34.5%±0.92,與H2O2模型組相比有顯著差異(P<0.05,P<0.01)。(2) AO-EB檢測結果發(fā)現(xiàn),對照組VEC未發(fā)生細胞凋亡,H2O2模型組可見大量VEC呈現(xiàn)典型凋亡形態(tài)學改變;低、中和高劑量 SFI預處理明顯抑制 H2O2氧化應激引起的細胞凋亡形態(tài)學改變,減少VEC凋亡。(3)蛋白印跡結果顯示,與對照組相比,H2O2模型組VE

11、C中Caspase-3與Bax蛋白表達顯著增加,而Bcl2蛋白表達明顯減少(P<0.01);與H2O2模型組相比,除低劑量SFI組VEC中Caspase-3蛋白表達無明顯改變外(P>0.05),中、高劑量SFI組VEC中Caspase-3蛋白表達均顯著降低(P<0.05),而低、中和高劑量SFI組Bcl2蛋白表達較H2O2模型組均顯著增加,Bax蛋白表達較H2O2模型組明顯降低(P<0.05,P<0.01)。
　　5.(1)與對照

12、組相比較, H2O2模型組 TXB2、6-K-PGF1α含量明顯增加(P<0.01,P<0.05);與H2O2模型組相比,低、中和高劑量SFI均可顯著降低TXB2以及TXB2/6-K-PGF1α(T/K)水平(P<0.01),低、中劑量SFI組6-K-PGF1α含量無明顯改變(P>0.05),但高劑量SFI組6-K-PGF1α含量明顯降低(P<0.05)。(2)H2O2模型組TXAS mRNA表達較對照組明顯增加(P<0.01);與H2

13、O2模型組比較,低、中和高劑量 SFI組 VEC中 TXAS mRNA表達明顯減少(P<0.05,P<0.01)。
　　結論:
　　1.5,10,20,30,40μ l/ml SFI對VEC無損傷作用,80,160μ l/ml SFI可明顯引起VEC細胞形態(tài)損傷性改變。
　　2.參附注射液對H2O2氧化應激誘導損傷的VEC抗氧化能力有保護作用,其保護作用機制與提高抗氧化酶SOD和GSH-PX活性,降低MDA含量,減少膜

14、脂質(zhì)過氧化有關。
　　3.參附注射液對H2O2氧化應激誘導VEC凋亡有抑制作用,其機制涉及提高 VEC的存活率,上調(diào) VEC中抗凋亡蛋白 Bcl2表達,同時下調(diào)促凋亡蛋白Caspase-3和Bax的表達。
　　4.參附注射液能保護H2O2氧化應激誘導損傷的VEC抗凝血活性,其保護機制與其減少TXB2,調(diào)節(jié)TXB2/6-K-PGF1α比值平衡,以及降低TXAS mRNA表達相關。
　　5.本實驗顯示,參附注射液可能通過提