1、脆性X智力低下1號基因1(fragileXmental retardationgene1, Fmr1)是一個(gè)高度保守的基因, cDNA全長4661bp,位于染色體Xq27.3,由17個(gè)外顯子和16個(gè)內(nèi)含子組成，長38 Kb。該基因的5'端非翻譯區(qū)有一個(gè)（CGG)n重復(fù)序列，該序列上游250bp處有一個(gè)基因啟動子，即CpG島。當(dāng)(CGG)n重復(fù)數(shù)在40~60之間時(shí)為Fmr1基因中間突變，CpG島無異常甲基化，個(gè)體常無異常表型或具有輕微的行

2、為問題；當(dāng)（CGG) n重復(fù)數(shù)在50~200之間時(shí)為Fmr1基因前突變, CpG島亦無異常甲基化，個(gè)體常出現(xiàn)脆性X相關(guān)性震顫/共濟(jì)失調(diào)綜合征（fragile X associated tremorand ataxia syndrome,FXTAS)和卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）；當(dāng)（CGG) n重復(fù)數(shù)超過200時(shí)為全突變,常伴有CpG島異常甲基化,使Fmr1 mRNA的翻譯受抑制,即脆性X智力低

3、下蛋白（fragileX mental retardation protein，F(xiàn)MRP）表達(dá)減少、缺失或功能喪失，從而引起脆性X綜合征（fragile X syndrome，F(xiàn)XS）。研究發(fā)現(xiàn)（CGG) n重復(fù)數(shù)與絕經(jīng)年齡有關(guān)，（CGG) n重復(fù)數(shù)為80~200之間，絕經(jīng)年齡最早，另外Fmr1基因前突變攜帶者可發(fā)生高卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）和早絕經(jīng)，2l％女性Fmr1基因前突變攜帶

4、者可發(fā)生POF，3％一15％的散發(fā)性POF是Fmr1基因前突變攜帶者，以上提示Fmr1基因可調(diào)節(jié)女性的生殖功能。Fmr1基因敲除小鼠是在Fmr1基因的第5個(gè)外顯子中插入了一個(gè)新霉素表達(dá)片斷，從而阻斷了500bpDNA片斷的擴(kuò)增，導(dǎo)致FMRP表達(dá)的缺失而制備成FXS的動物模型，在該基因敲除小鼠（knockoutmice，KO鼠）及野生型小鼠（wild type mice,WT鼠）的繁育過程中，發(fā)現(xiàn)Fmr1基因的缺失會對動物的生產(chǎn)量產(chǎn)生影響

5、，研究也發(fā)現(xiàn)KO雄鼠的生育能力和WT小鼠相比是下降的，KO雄鼠與雌鼠合籠后的30min內(nèi)少數(shù)雄鼠沒有明顯的追逐、環(huán)抱及性行為。因此本實(shí)驗(yàn)前半部分將通過觀察小鼠的合籠情況來比較KO純合子、KO雜合子及WT雌鼠的生殖功能，探討Fmr1基因缺失會對雌性小鼠的生殖功能產(chǎn)生哪些影響？若Fmr1基因?qū)ι彻δ苡杏绊懀敲此峭ㄟ^何種途徑來調(diào)控生殖功能的呢？FMRP是一種選擇性RNA結(jié)合蛋白，通過其功能域可以選擇性地與包括自身mRNA及與神經(jīng)發(fā)育、樹

6、突可塑性、配子生成等各種mRNA相結(jié)合，對RNA轉(zhuǎn)運(yùn)、mRNA的穩(wěn)定性起作用，在腦組織中，F(xiàn)MRP可調(diào)節(jié)其他蛋白的表達(dá)，影響突觸的發(fā)育和神經(jīng)細(xì)胞的可塑性，進(jìn)而導(dǎo)致FXS患者智力低下和行為問題。在性腺組織中，F(xiàn)MRP在卵巢、睪丸組織中同樣高度表達(dá)，F(xiàn)MRP可調(diào)節(jié)卵巢的儲備功能，因此我們猜測它的完全或部分缺失可能影響其他調(diào)節(jié)生殖功能的蛋白的轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而影響生殖功能？神經(jīng)肽Y(Neuropeptide Y,NPY)是一種肽類物質(zhì),廣泛分布

7、于哺乳動物的中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)中，與下丘腦神經(jīng)內(nèi)分泌的調(diào)節(jié)密切相關(guān)。NPY可抑制促性腺激素釋放激素（gonadotropin-releasing hormone，GnRH）的脈沖式釋放；對排卵前的LH峰有促進(jìn)作用；同時(shí)NPY可影響卵巢的血流，調(diào)節(jié)卵泡的生長，在生殖功能的調(diào)節(jié)中起重要的作用。本實(shí)驗(yàn)將探索KO、WT鼠其下丘腦及周圍血中NPY的表達(dá)是否有差異？Fmr1基因是否是通過調(diào)控NPY的表達(dá)而影響雌鼠的生殖功能的？Γ-氨基丁酸（gamm

8、a-aminobutyric acid，GABA）是中樞的一種抑制性氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)，可通過下丘腦-垂體-性腺軸影響垂體和性腺的生理機(jī)能，也可以通過多巴胺系統(tǒng)抑制黃體生成素（luteinizing hormone，LH）和泌乳素（prolactin， PRL）的分泌，從而調(diào)節(jié)生殖功能。在對KO鼠的研究中已發(fā)現(xiàn)其GABA受體（gamma-aminobutyric acidreceptor，GABAR）的活性是降低的，那么Fmr1基因是否能

9、通過影響GABA或GABAR的活性來影響雌鼠的生殖功能呢？
　　目的：本實(shí)驗(yàn)比較KO純合子、KO雜合子、WT雌鼠三者的生殖能力，明確Fmr1基因的缺失是否會對雌性小鼠的生殖功能產(chǎn)生影響，通過免疫組織化學(xué)方法、酶聯(lián)免疫吸附測定法觀察NPY、GABA在KO鼠及WT鼠下丘腦及血清的表達(dá)，初步探討Fmr1基因調(diào)控雌鼠生殖功能的可能機(jī)制。
　　方法：⑴實(shí)驗(yàn)動物：純合子（-/-）Fmr1基因敲除型（KO純合子）、雜合子（+/-） Fmr

10、1基因敲除型（KO雜合子）及其純合子(+/+)野生型(WT) FVB近交系小鼠。⑵動物基因型鑒定：采用PCR法檢測實(shí)驗(yàn)小鼠的Fmr1基因片段。⑶用于繁殖力試驗(yàn)的成年的KO純合子雌鼠、KO雜合子雌鼠、WT雌鼠和成年的WT雄鼠，每組至少15只。⑷用于免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)的10周的KO純合子雌鼠、KO雜合子雌鼠、WT雌鼠，每組至少6只。⑸用于酶聯(lián)免疫吸附測定實(shí)驗(yàn)的10周的KO純合子雌鼠、KO雜合子雌鼠、WT雌鼠，每組12只。⑺實(shí)驗(yàn)方法及觀測指標(biāo)：

11、通過合籠實(shí)驗(yàn)觀察 KO純合子、KO雜合子及 WT雌鼠的合籠時(shí)間及產(chǎn)仔數(shù)；通過蘇木素-伊紅染色觀察三組雌鼠的卵巢組織形態(tài)及進(jìn)行卵泡計(jì)數(shù)；通過免疫組織化學(xué)染色方法測定下丘腦NPY及GABA的表達(dá)；通過酶聯(lián)免疫吸附測定法測定血清NPY的表達(dá)。⑺數(shù)據(jù)及圖像的采集：免疫組化結(jié)果應(yīng)用 Olympus- BH22型光學(xué)顯微鏡攝片，每個(gè)切片200倍鏡下取5個(gè)視野，用Image J圖像分析軟件進(jìn)行NPY免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)，用Image Pro Plus

12、6.0圖像分析軟件進(jìn)行GABA免疫反應(yīng)平均光密度值的測定。⑻統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：所有數(shù)據(jù)采用SPSS16.0軟件進(jìn)行分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料以x±s表示，正態(tài)分布資料多組樣本的比較采用One-way ANOVA,組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：①經(jīng)基因鑒定，KO純合子小鼠基因型為（-/-），KO雜合子小鼠基因型為（+/-），WT小鼠基因型為(+/+)。②繁殖力試驗(yàn)結(jié)果： KO純合子雌鼠的產(chǎn)仔數(shù)少于W

13、T雌鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)， P<0.05；三組雌鼠與野生型雄鼠的合籠天數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05；三組雌鼠相比，其卵巢組織形態(tài)未見明顯不同；KO純合子雌鼠的卵泡總數(shù)少于WT雌鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)，P<0.05。③免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：下丘腦室周核、正中隆起、下丘腦外側(cè)區(qū)、弓狀核、背側(cè)區(qū)及腹內(nèi)側(cè)核均可見NPY陽性細(xì)胞的表達(dá)，正中隆起、下丘腦弓狀核及背側(cè)區(qū)這些與生殖調(diào)節(jié)密切相關(guān)的區(qū)域，其NPY表達(dá)更強(qiáng)烈，三種基因型雌鼠其NPY的表達(dá)部位無明

14、顯不同，經(jīng)統(tǒng)計(jì)，KO純合子雌鼠下丘腦NPY陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)少于WT雌鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)，P<0.05；下丘腦弓狀核、室周核、腹內(nèi)側(cè)核背部和腹部以及下丘腦背側(cè)區(qū)均有GABA陽性細(xì)胞的表達(dá)，在下丘腦弓狀核和室周核GABA表達(dá)更強(qiáng)烈，三種基因型雌鼠其GABA的表達(dá)部位未見明顯不同。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，三種基因型雌鼠其下丘腦GABA的表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05。④酶聯(lián)免疫吸附測定實(shí)驗(yàn)結(jié)果：三組雌鼠血清NPY的表達(dá)量兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.0