1、【研究目的】
　　脆性X綜合征（Fragile X syndrome,FXS）是一種常見的遺傳性智力低下疾病，其臨床癥狀主要包括癲癇、多動癥、對刺激敏感性增加等神經元興奮性增加癥狀。脆性x綜合征是由于脆性X智力低下蛋白（FMRP）缺失而引起的，F(xiàn)MRP作為一種RNA結合蛋白，可與多種RNA結合，可作為翻譯抑制因子負性調控多種RNA的翻譯。代謝型谷氨酸受體（metabotropic glutamate receptors,mGluR

2、）與FXS的病理生理機制密切相關，F(xiàn)MRP是1組代謝型谷氨酸受體信號通路的重要抑制蛋白，其缺失將導致該通路異?？哼M，影響其下游一系列蛋白的表達水平，其中可能包括一部分影響神經元興奮性的蛋白，如離子通道蛋白。FXS中神經元興奮性增加可能和亢進的mGluR信號通路密切相關。鉀電流是動作電位復極化時程最重要的電流，鉀電流水平下降可導致動作電位發(fā)放增多，時程延長等變化，導致神經元興奮性增高。因此我們猜測鉀電流很可能是Group1 mGluR的下

3、游調控對象，該通路通過調控鉀鉀電流的水平影響神經元興奮性。本研究主要選取10天齡野生型（WT）和Fmr1基因敲除（KO）小鼠，研究了Group1 mGluR對神經元動作電位發(fā)放及突觸傳遞的影響，并探索鉀電流對突觸傳遞效能的影響，最后比較兩組小鼠全細胞鉀電流水平差異，并且研究了Group1 mGluR對鉀電流特性的影響，總結探討鉀電流在Group1 mGluR調控KO小鼠神經元興奮性中的作用。
　　【實驗方法】
　　1.制備K

4、O和WT小鼠急性分離海馬腦片。
　　2.在全細胞記錄模式下記錄KO和WT小鼠海馬CA1區(qū)神經元動作電位和EPSC發(fā)放特性，比較兩者差異，并使用Group1 mGluR激動劑和拮抗劑研究Group1 mGluR對兩組神經元輸入和輸出特性的影響。
　　3.在電壓鉗模式下，研究Group1 mGluR拮抗劑MPEP對WT和KO小鼠神經元全細胞鉀電流的影響，通過分析鉀電流峰電導、激活、失活、復活等特性評價Group1 mGluR信號

5、通路對鉀通道的調控作用。
　　【研究結果】
　　1.使用電流鉗技術對WT和KO小鼠神經元動作電位的發(fā)放研究發(fā)現(xiàn)，Group1 mGluR激動劑(S)-3,5-dihydroxyphenylglycine（DHPG）可顯著增加WT組神經元動作電位發(fā)放頻率（P＜0.05,paired t test.n=8），而對KO組作用無統(tǒng)計學意義。相反，Group1 mGluR拮抗劑2-methyl-6-(phenylethynyl)pyr

6、idine（MPEP）可以顯著抑制KO組神經元動作電位頻率（P＜0.01,paired t test.n=9），但對WT組作用無顯著作用。對神經元爆發(fā)樣放電事件分析中發(fā)現(xiàn)，DHPG顯著增加WT組爆發(fā)樣放電事件頻率（P＜0.05,paired t test.n=8），但對KO組作用不顯著，而MPEP則顯著減少KO和WT兩組爆發(fā)樣放電頻率（P＜0.01,paired t test.n=8,for WT;n=9,for KO），且MPEP導致

7、的爆發(fā)樣放電頻率降低的百分比在兩組神經元有顯著的差異（P＜0.01,ttest.n=8,for WT;n=9,for KO）。進一步研究誘發(fā)性動作電位中發(fā)現(xiàn)，不論在出生后組還是30天齡組，KO小鼠爆發(fā)樣放電神經元比例更高（p=0.0040,for P10;p=0.036 for P30,Chi-square test），且MPEP可以降低兩組神經元誘發(fā)的動作電位的頻率（p=0.0090,for group P10;p=0.0308,fo

8、r P30,one-way ANOVA and post-hoc LSDtest.n=7,for WT for P10;n=8 for KO for P10 and KO for P30;n=9 for WT P30），甚至導致爆發(fā)樣放電模式轉變常規(guī)放電模式，此現(xiàn)象在10天齡KO組上更為顯著（p=0.0419,Chi-square test）。提示mGluR受體通路的亢進與脆性小鼠的神經異常放電有關，MPEP的拮抗作用可顯著改變動作電位

9、的發(fā)放頻率和模式。
　　2.使用電壓鉗技術對WT和KO小鼠神經元sEPSC發(fā)放的研究顯示，KO組神經元sEPSC的數(shù)量、平均頻率、平均波幅均顯著高于WT組（平均波幅P＜0.05;平均頻率、數(shù)量P＜0.01,t test.n=6,for WT;n=5,for KO）。MPEP可減少WT組sEPSC的數(shù)量和平均頻率（數(shù)量,P＜0.01;平均頻率,P＜0.05,paired t test.n=6,for WT;n=5,for KO）；M

10、PEP還可顯著降低KO組sEPSC數(shù)量和平均波幅（P＜0.05, paired t test.n=6,for WT;n=5,for KO），其中對平均波幅的降低百分比與WT組相比較具有顯著差異（P＜0.05,t test.n=6,for WT;n=5,forKO）。結果提示KO神經元亢進的mGluR通路是其興奮性突觸傳遞增高的重要原因之一。
　　3.在海馬Schaffer collateral投射通路中給予誘發(fā)刺激，記錄WT和KO

11、小鼠CA1神經元的誘發(fā)性EPSC(eEPSC)。結果顯示KO組神經元eEPSC波幅和延遲時間水平均比WT組顯著增高（P＜0.05,t test.n=4,for WT;n=5,for KO）。鉀通道阻斷劑4-AP可顯著提高WT組神經元eEPSC波幅和延長時間（波幅,P＜0.05;延長時間,P＜0.01,paired t test.n=4,for WT;n=5,for KO），而對KO組影響不顯著。此外，4-AP可顯著提高WT組神經元雙脈沖

12、刺激比率（PPR）（P＜0.01,paired t test.n=4, for WT;n=5,for KO），但對KO組影響不顯著。結果提示KO和WT神經元的突觸傳遞強度存在顯著差異，而在WT神經元中利用4-AP減少鉀電流可產生與KO神經元的突觸傳遞和突觸傳遞易化特性的相對應的改變，推測鉀電流參與了KO神經元的突觸傳遞特性改變。
　　4.利用電壓鉗技術對WT和KO小鼠研究全細胞鉀電流證實了KO組鉀電流峰值和穩(wěn)態(tài)鉀電流均比 WT組下

13、降（P＜0.01,one-way ANOVA and post-hoc LSD test.n=5,for WT;n=6,for KO）。MPEP可顯著提高KO組神經元最大鉀電流電導（P＜0.05,one-way ANOVA and post-hoc LSD test.n=5, for WT;n=5, for KO），并有效降低鉀電流復活時間常數(shù)（P＜0.05, one-way ANOVA and post-hoc LSD test.n=

14、5,for WT;n=5,for KO），而對WT組效果不顯著；MPEP不影響激活和失活動力學參數(shù)。結果提示mGluR的拮抗可部分挽救KO神經元鉀電流的降低，推測鉀電流的調節(jié)是MPEP治療脆性X綜合征的重要機制。
　　【結論】
　　1.Fmr1敲除鼠海馬CA1區(qū)神經元興奮性增高與代謝型谷氨酸信號通路功能亢進密切相關。
　　2.拮抗Fmr1敲除鼠亢進的mGluR信號通路可有效降低Fmr1敲除鼠海馬CA1區(qū)神經元突觸傳遞效