1、 研究背景與目的：
腫瘤干細胞學(xué)說認為腫瘤中存在一群數(shù)量極少,具有自我更新和分化能力的腫瘤細胞,即腫瘤干細胞(Cancer stem cell,CSC)。目前研究發(fā)現(xiàn),腫瘤干細胞是維持腫瘤生長、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的根源,消滅腫瘤干細胞可能成為治愈腫瘤、防止復(fù)發(fā)的新方向。同時,研究發(fā)現(xiàn)一些mircoRNA(miRNA)的異常表達導(dǎo)致了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展,并廣泛參與了腫瘤細胞的增殖、分化、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)。本實驗旨在探討通過非粘附

2、球培養(yǎng)法從肝癌細胞系中富集肝癌干細胞,利用基因芯片技術(shù)篩查腫瘤細胞和腫瘤干細胞的miRNA表達譜,分析兩者表達譜的差異,為進一步探討miRNA在肝癌干細胞分化中的作用和調(diào)控機制提供新的線索。
方法：
1、應(yīng)用非粘附球培養(yǎng)法從肝癌細胞系中富集到肝癌干細胞樣細胞球,并進行體外擴增。利用腫瘤干細胞的一些特性對富集到的肝癌干細胞樣細胞球進行鑒定。
2、將通過鑒定的肝癌干細胞提取總 RNA。利用紫外分光光度計和

3、瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)對提取的RNA進行質(zhì)量檢測。對符芯片要求的RNA進行熒光標記再與Exiqon miRNA基因表達譜芯片進行雜交。然后用掃描得到的芯片結(jié)果進行miRNA表達差異分析。
結(jié)果：
1、利用非粘附球培養(yǎng)法可以在Hep3B、 HepG2、 Huh7細胞系中富集得到懸浮成球生長的細胞球且都能持續(xù)傳代。且單細胞成球?qū)嶒炞C實懸浮細胞球是由單個細胞增殖形成,不是多個細胞聚集。
2、富集得到的Huh7懸

4、浮細胞球細胞體外形成的集落數(shù)是Huh7細胞二倍。說明細胞球細胞體外集落形成能力較Huh7細胞強。
3、Huh7 細胞被甲苯胺藍染成藍紫色,而 Huh7 懸浮細胞球細胞不能被染色,說明干細胞培養(yǎng)條件下的腫瘤細胞球的細胞通透性降低。
4、流式檢測Huh7懸浮細胞球細胞的干細胞標志分子CD326為93%,腫瘤細胞的CD326為0.2%,表明在Huh7懸浮細胞球細胞的干細胞特異性分子表達明顯上調(diào)。
5、裸鼠成

5、瘤實驗顯示5000個Huh7懸浮細胞球細胞細胞就能使裸鼠成瘤,而huh7最少需要10萬個才能成瘤。說明Huh7懸浮細胞球細胞的成瘤性遠遠大于普通腫瘤細胞。
6、分別取Huh7細胞和第3代的Huh7懸浮細胞球細胞用Trizol法提取總RNA,并用紫外分光光度計測得OD280/260值分別為2.04；2.07 。瓊脂糖電泳得到的28s、18srRNA條帶明亮清晰,亮度比值約為2：1,miRNA完整性好符合芯片檢測要求。

6、 7、利用 Hy3TM對樣本 RNA 進行標記后跟 miRNA 芯片進行雜交,用Genepix 4000B 對圖像進行掃描分析,把圖像信號用Genepix Pro6.0 軟件轉(zhuǎn)化成數(shù)字信息并進行數(shù)據(jù)分析。從結(jié)果中可以看出miRNA在肝癌細胞和肝癌干細胞中的表達有顯著差異。
8、miRNA芯片分析：共獲得 383個差異表達的miRNAs,其中110個表達上調(diào),273 個表達下調(diào),部分表達差異明顯的 miRNAs 可能與調(diào)控肝