1、目的: 研究肝癌細(xì)胞系 LM3經(jīng)微球體培養(yǎng)后對干細(xì)胞相關(guān)蛋白Oct-4、Sox2、Wnt-5b、Nanog表達(dá)的影響，同時(shí)對微球體的特征進(jìn)行鑒定,為肝癌干細(xì)胞的研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法: 應(yīng)用干細(xì)胞培養(yǎng)體系和微球體懸浮培養(yǎng)法從肝癌細(xì)胞系LM3中富集到微球體，并對微球體進(jìn)行一系列的特征鑒定。包括：（1）微球體形成時(shí)間及大??；（2）蛋白質(zhì)免疫印跡及免疫熒光檢測LM3細(xì)胞與微球體細(xì)胞中干細(xì)胞相關(guān)蛋白Oct-4、Sox2、Wnt-5b

2、、Nanog表達(dá)；（3）蛋白質(zhì)免疫印跡檢測LM3細(xì)胞與微球體細(xì)胞中p-ERK1/2、ERK1/2、p-AMPK、AMPK表達(dá)；（4）蛋白質(zhì)免疫印跡檢測 LM3細(xì)胞與微球體細(xì)胞中 EMT相關(guān)蛋白E-cadherin、N-cadherin、Vimentin表達(dá)，免疫熒光檢測LM3細(xì)胞與微球體細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白E-cadherin表達(dá)；（5）MTT實(shí)驗(yàn)檢測LM3細(xì)胞與微球體細(xì)胞對阿霉素耐受能力；（6）劃痕實(shí)驗(yàn)檢測LM3細(xì)胞與微球體細(xì)胞遷移能

3、力；（7） NOD／SCID小鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)檢測LM3細(xì)胞與微球體細(xì)胞成瘤能力。
　　結(jié)果: （1）干細(xì)胞培養(yǎng)體系和微球體懸浮培養(yǎng)法可以使肝癌細(xì)胞快速形成微球體，培養(yǎng)至第7天時(shí)，微球體的直徑可以達(dá)到450μm；（2）蛋白質(zhì)免疫印跡檢測及免疫熒光檢測結(jié)果顯示微球體細(xì)胞中干細(xì)胞相關(guān)蛋白Oct-4、Sox2、Wnt-5b、Nanog的表達(dá)量均高于LM3細(xì)胞（P<0.01或P<0.05）；（3）蛋白質(zhì)免疫印跡檢測結(jié)果顯示微球體細(xì)胞中p-E

4、RK1/2、ERK1/2的表達(dá)量高于LM3細(xì)胞（P<0.001），p-AMPK、AMPK的表達(dá)量低于LM3細(xì)胞（P<0.001）；（4）蛋白質(zhì)免疫印跡檢測結(jié)果顯示微球體細(xì)胞中E-cadherin的表達(dá)量高于LM3細(xì)胞（P<0.05），N-cadherin、Vimentin的表達(dá)量低于LM3細(xì)胞（P<0.001或P<0.05）；免疫熒光檢測結(jié)果顯示微球體細(xì)胞中E-cadherin的表達(dá)量高于LM3細(xì)胞；（5）MTT實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示微球體細(xì)

5、胞耐受阿霉素的能力比 LM3細(xì)胞強(qiáng)（P<0.05）；（6）劃痕實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示微球體細(xì)胞的遷移能力比LM3細(xì)胞強(qiáng)（P<0.01）；（7）NOD／SCID小鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示微球體細(xì)胞的成瘤能力比LM3細(xì)胞強(qiáng)。
　　結(jié)論: 干細(xì)胞培養(yǎng)體系和微球體懸浮培養(yǎng)法可以使肝癌細(xì)胞系LM3快速形成微球體，微球體細(xì)胞中干細(xì)胞相關(guān)蛋白Oct-4、Sox2、Wnt-5b、Nanog的表達(dá)量均增高，p-ERK1/2、ERK1/2的表達(dá)量增高,