1、肝癌的發(fā)生是許多基因表達水平的改變導(dǎo)致細胞內(nèi)出現(xiàn)一系列分子變化的結(jié)果。因而從基因水平研究肝癌的癌基因、抑癌基因的變化，尋找差異表達的基因，不僅可以在病理上尋找原因，同時可以為早期診斷和治療以及預(yù)后提供依據(jù)。
　　ErbB-3是表皮生長因子家族中的重要成員，而Ebpl（Ebp1）是新發(fā)現(xiàn)的一種 ErbB-3胞內(nèi)結(jié)合蛋白。在外界刺激作用下 Ebpl與 ErbB-3分離到達核內(nèi)，可抑制腫瘤細胞的生長增殖并誘導(dǎo)細胞分化。研究表明Ebpl抑

2、制細胞增殖的能力與其調(diào)控細胞周期相關(guān)基因有關(guān)。研究顯示，Ebpl基因具有p48和p42兩個部分，兩者表達對細胞增殖起不同的效應(yīng)。p48位于細胞質(zhì)和核內(nèi)，過度表達促進細胞增值；而p42位于細胞質(zhì)內(nèi)，過度表達時將抑制細胞增值。盡管文獻報道，Ebp1與乳腺癌、前列腺癌及口腔鱗狀細胞癌細胞生長增殖有關(guān)，但是其在肝癌中的作用研究尚未見報道。由于綠色熒光蛋白（GFP）可在真核細胞內(nèi)表達發(fā)出綠色熒光，可起到示蹤作用，因此，利用Northern blo

3、t方法觀察Ebp1基因mRNA在肝癌細胞中的表達，之后建立pEGFP-C1質(zhì)粒為載體的pEGFP-C1-Ebp1真核表達質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染到HEK293細胞，觀察Ebp1過表達對細胞生長增殖的影響。
　　首先提取培養(yǎng)的肝癌細胞中提取總RNA進行Northern blot觀察Ebp1基因mRNA的表達，之后利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)擴增Ebp1基因，并建立Ebp1基因與綠色熒光蛋白（GFP）基因融合表達載體pEGFP-Ebp1；使用

4、脂質(zhì)體法，將重組的Ebp1基因轉(zhuǎn)入293細胞，并利用熒光顯微鏡觀察細胞內(nèi)綠色熒光的表達，轉(zhuǎn)染后第二天開始利用新霉素G418篩選，建立穩(wěn)定表達目的基因Ebp1的細胞系及分析克隆集落的形成，對陽性表達克隆細胞通過Western blot鑒定Ebp1蛋白的表達。
　　實驗結(jié)果如下：Northern blot結(jié)果顯示，與NIH3T3和HEK293細胞相比Hep3B、Hep G2和Huh-7肝癌細胞系中Ebp1基因mRNA過表達；構(gòu)建了Eb

5、p1與EGFP融合表達載體pEGFPC1-Ebp1，且熒光顯微鏡下可見被轉(zhuǎn)染的HEK293細胞發(fā)出綠色熒光；Western blot鑒定結(jié)果穩(wěn)定表達細胞系過表達Ebp1蛋白；克隆集落形成實驗結(jié)果，轉(zhuǎn)染目的基因的細胞克隆數(shù)多于轉(zhuǎn)染空載體細胞。
　　以上的結(jié)果提示：
　　1.構(gòu)建了Ebp1與GFP基因融合表達載體pEGFPC1-Ebp1，而且建立了穩(wěn)定表達該真核表達載體的HEK293細胞系；
　　2.肝癌細胞中Ebp1基因