1、目的：通過檢測肺癌患者胸水與自身外周血以及健康志愿者外周血 T細胞受體TCR Vβ表達譜來分析肺癌特異性的TCR基因優(yōu)勢取用及克隆增殖情況，并克隆肺癌特異性TCR Vβ基因構建重組嵌合型腺病毒pDC315-TCR Vβ。研究肺癌特異性TCR Vβ基因修飾的PBMC對不同腫瘤細胞的殺傷作用，為TCR基因修飾T細胞進行過繼性腫瘤免疫治療研究打下基礎。
　　方法：
　　一、收集肺癌患者胸水并利用流式細胞術以及Gexp方法來檢測TC

2、R Vβ亞家族的比例變化及克隆增殖情況，分析肺癌特異性的TCR Vβ亞家族。
　　二、提取肺癌患者胸水細胞總RNA，克隆肺癌患者胸水TILs中呈現(xiàn)寡克隆增殖的的TCR Vβ基因并構建腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC315-TCR Vβ。
　　三、通過 Lipofectamine2000脂質(zhì)體將嵌合型腺病毒骨架質(zhì)粒與重組穿梭質(zhì)粒pDC315-TCR Vβ共轉染HEK293細胞，獲得能表達TCR Vβ基因的重組腺病毒。通過提取病毒基因組PC

3、R鑒定外源目的基因和利用病毒感染PBMC后通過流式檢測目的基因表達量來鑒定重組嵌合型腺病毒是否能正確表達外源基因。大量擴增鑒定正確的重組嵌合型腺病毒，通過層析純化系統(tǒng)將病毒純化并用TCID50法測定滴度。
　　四、將HLA-A2基因克隆到pcDNA3.1載體中獲得重組質(zhì)粒pcDNA3.1-HLA-A2，利用Lipofectamine2000脂質(zhì)體將重組質(zhì)粒轉染NCI-H1299和A549細胞，并用敏感的G418濃度對細胞進行篩選。

4、從而獲得穩(wěn)定表達HLA-A2的細胞株。
　　五、用重組 TCRVβ腺病毒感染 PBMC，36小時后分別作用于肺癌細胞株NCI-H1299（HLA-A2+）、NCI-H1299（HLA-A2-）、A549（HLA-A2-），肝癌細胞株huh-7（HLA-A2+），乳腺癌細胞株 Mcf-7（HLA-A2+）。分別在作用12小時、24小時以及36小時后用MTT法檢測殺傷效果。
　　結果：流式檢測發(fā)現(xiàn)肺癌患者胸水TIL中TCR Vβ

5、8亞家族比例顯著升高，而Gexp檢測結果示P2患者高表達的TCR Vβ8基因呈現(xiàn)寡克隆性增殖。PCR及測序結果表明從P2患者胸水中成功克隆獲得TCR Vβ8.1-VJ1.3基因，并正確構建重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC315- TCR Vβ8.1-VJ1.3。利用腺病毒包轉系統(tǒng)包裝出重組腺病毒，從重組病毒基因組中PCR擴增得到基因TCR Vβ8.1-VJ1.3，說明目的基因成功整合到病毒基因組中。流式細胞術檢測重組病毒感染的PBMC表明目的基

6、因可以有效的表達?？鼓[瘤實驗發(fā)現(xiàn)TCR Vβ8.1-VJ1.3基因轉染PBMC的抗腫瘤能力為NCI-H1299(HLA-A2+)>A549(HLA-A2-)>huh-7(HLA-A2+)>NCI-H1299(HLA-A2-)>MCF-7(HLA-A2+)。
　　結論：肺癌患者TILs中TCR Vβ8的比例明顯升高并呈寡克隆增殖，推測可能是由于在腫瘤局部的特異性抗原誘導產(chǎn)生的。從高表達TCR Vβ8并呈現(xiàn)寡克隆性增殖的肺癌患者胸水中