1、目的:采用腫瘤患者自體外周血來源單個核細(xì)胞體外培養(yǎng)成為成熟的DC并加入患者自體的TDLN細(xì)胞中代替原有的受腫瘤抑制的DC,以研究TDLN細(xì)胞的抗腫瘤活性。
　　 方法:
　　 1分離與培養(yǎng)人外周血樹突狀細(xì)胞(DC);通過倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長及形態(tài)變化情況。通過掃描電鏡觀察DC的超微結(jié)構(gòu)。
　　 2通過流式細(xì)胞技術(shù)測定從外周血中培養(yǎng)的樹突狀細(xì)胞的CD83、CD1α、CD80、CD86的陽性表達(dá)率。
　　

2、 3取食管癌患者引流淋巴結(jié)組織進行體外培養(yǎng),用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞免疫分子表型。
　　 4采用四甲基偶氮唑藍(lán)法(MTT)檢測試驗中DC與TDLN以不同比例(1:12.5、1:25、1:50、1:100)與TE1共同作用不同時間(12h、24h、48h和72h)后,對TE1細(xì)胞增殖反應(yīng)的抑制作用:檢測TDLN單獨與TE1共同作用不同時間(12h、24h、48h和72h)后,對TE1細(xì)胞增殖反應(yīng)的抑制作用;檢測(對照組)DC與TDLN

3、以不同比例(1:12.5、1:25、1:50、1:100)與.A375共同作用不同時間(12h、24h、48h和72h)后,對A375細(xì)胞增殖反應(yīng)的抑制作用。
　　 5分別將TDLN細(xì)胞與成熟DC細(xì)胞(1:50)共培養(yǎng)3d,DC細(xì)胞培養(yǎng)至第7d時,收取培養(yǎng)上清,用ELISA法檢測IL-12p70、IFN-γ和TNF-α含量。
　　 6采用RT-PCR法檢測(實驗組)DC與TDLN不同比例(1:12.5,1:25,1:50

4、,1:100)與TE1共同作用后,TE1細(xì)胞Bcl-2、Bax、survivin等基因的表達(dá)變化;
　　 結(jié)果:
　　 1外周血單個核細(xì)胞來源DC的形態(tài)學(xué)外周血單個核細(xì)胞經(jīng)GM-CSF、IL-4于體外誘導(dǎo)培養(yǎng)5d后,呈現(xiàn)典型未成熟樹突狀細(xì)胞形態(tài),細(xì)胞體積較小,表面毛刺狀突起較少,細(xì)胞成簇分布,呈集落樣生長:加入TNF-α后1-2d,具有典型成熟特征的DCs,細(xì)胞體積較大,形態(tài)不規(guī)則,表面有大量細(xì)而長的樹突狀突起，細(xì)胞中可

5、見數(shù)量不等的細(xì)胞集落形成。
　　 2電鏡下觀察可見,未加入腫瘤壞死因子的細(xì)胞體積增大不明顯,表面有部分細(xì)小的突起,呈現(xiàn)未成熟樹突狀細(xì)胞的形態(tài);而加入TNF-α組細(xì)胞體積有所增大,表面毛刺狀突起也明顯增多,可見成熟的樹突狀細(xì)胞形態(tài)。
　　 3流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示,將外周血單個核細(xì)胞于體外誘導(dǎo)培養(yǎng)第7d時,加入TNF-α組,細(xì)胞呈CD80、CD86雙陽性率可達(dá)56.97±3.92％,未加入TNF-α組DC表面CD80、CD86

6、雙陽性率僅為24.88±6.23％,兩組間有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05);加入TNF-α組DC的CD1α、CD83雙陽性表達(dá)率分別為42.60±7.08％,未加入TNF-α組DC的CD1α、CD83雙陽性表達(dá)率28.56±12.45％,兩組間有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。
　　 4流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示,TDLN細(xì)胞主要由CD3+T細(xì)胞和CD83+成熟樹突細(xì)胞組成,其中CD3的陽性率為79.91±4.97％,CD83的陽性率為21

7、.36±4.33％。進一步分析的結(jié)果顯示,在CD3+T細(xì)胞中含有CD4的細(xì)胞陽性率為43.12±5.41％、CD8的細(xì)胞陽性率為38.76±4.83％。
　　 5 MTT分析結(jié)果顯示,DC與TNLD以1:50作用12、24、48、72小時,對TE1細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用。其中兩者比例為1:50,作用24小時,的抑制率最大(為49.57±0.98％),DC與TNLD以不同比例作用之間,對TE1細(xì)胞增殖的抑制率具有顯著性差異(p＜

8、0.05)。
　　 6 MTT分析結(jié)果顯示,DC與TNLD以任何比例作用12、24、48、72小時,對A375細(xì)胞增殖抑制率沒有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 7 ELISA法檢測結(jié)果顯示DCTDNL和DC細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-12、IFN-γ和NF-α的分泌水平,按1×106個DC/ml計算,三組DC上清中均能檢測到 IL-12、IFN-γ和TNF-α的分泌,DCTDNL組上清中IL-12、IFN-γ和TNF-α表達(dá)量高于DC組中I

9、L-12、IFN-γ和TNF-α表達(dá)量,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。
　　 8 RT-PCR技術(shù)檢測顯示,DC與TLND以不同比例(1:12.5、1:25、1:50、1:100)作用24h后,TE1細(xì)胞內(nèi)抗凋亡基因bcl-2、survivin表達(dá)水平均明顯降低,bax表達(dá)水平均明顯升高。以1:50比例作用時,TE1細(xì)胞內(nèi)抗凋亡基因bcl-2、survivin表達(dá)最低,凋亡基因bax表達(dá)最高(p＜0.05)。
　　

10、結(jié)論:
　　 1 HES(羥乙基淀粉)沉降法和密度梯度離心Ficoll法聯(lián)合分離、收集DC細(xì)胞,經(jīng)GM-CSF、IL-4和TNF-α聯(lián)合于體外培養(yǎng)7d,可收獲純度較高的成熟DC。
　　 2加入TNF-α因子組,DC呈成熟形態(tài),CD83、CD1α、CD80、CD86的陽性表達(dá)率高,提示TNF-α是刺激DC成熟的關(guān)鍵因子。
　　 3組織培養(yǎng)法收集TDLN細(xì)胞,體外經(jīng)IL-2共培養(yǎng)14d,可收獲功能完善、純度較高的TD

11、IN。
　　 4不同比例的DCTDLN細(xì)胞對TE1細(xì)胞殺傷能力均大于對A375細(xì)胞的殺傷能力,提示TDIN細(xì)胞可能在體內(nèi)已被致敏,有一定的特異性識別能力,而添加DC可提高的是TDLN細(xì)胞的特異性殺傷能力。
　　 5 DCTDLN細(xì)胞對TE1細(xì)胞的殺傷率與效靶比的變化有關(guān),DC與TNLD以1:50比例作用時殺傷率最高,與其他各比例相比,有統(tǒng)計學(xué)意義p＜0.05,提示DCTDLN細(xì)胞的特異性殺傷能力存在劑量效應(yīng),