1、金黃色葡萄球菌作為重要的致病菌，主要引起皮膚膿腫、菌血癥、致死性肺炎和化膿性心內(nèi)膜炎等。金黃色葡萄球菌同時也能以定植菌的形式，持續(xù)或者暫時存在于約10-30％的人群中，當宿主皮膚破損或免疫力低下時遷移至適當?shù)奈恢枚l(fā)感染。19世紀60年代出現(xiàn)了被稱為“超級細菌”的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌MRSA以來，金黃色葡萄球菌日益嚴重的耐藥情況使得對于其感染的治療成了臨床醫(yī)生一大棘手的問題。研發(fā)新的抗金黃色葡萄球菌的藥物或者疫苗迫在眉睫，發(fā)現(xiàn)新的

2、有效藥物或者疫苗的靶點已經(jīng)成為了目前國際研發(fā)的新熱點。
　　金黃色葡萄球菌的表面表達多種功能各異的蛋白，它們通常以共價的形式錨定在金黃色葡萄球菌細胞壁的肽聚糖上，因此這些表面蛋白被稱為細胞壁錨定蛋白。近年來多個研究報道證實了多種細胞壁錨定蛋白在金黃色葡萄球菌的定植和感染中起到重要作用。因為表達于金黃色葡萄球菌的表面，細胞壁錨定蛋白不僅易于被藥物分子或者抗體接觸，而且大多為細菌的重要毒力因子，因此常常成為藥物或者疫苗研發(fā)的新靶點。<

3、br>　　MRSA ST239克隆株在中國以及亞洲其它國家醫(yī)院環(huán)境內(nèi)廣泛流行。我們通過基因組比對研究發(fā)現(xiàn)了一種新的細胞壁錨定蛋白，它與表皮葡萄球菌的毒力因子SesⅠ同源性極高。通過已有的對于SesⅠ的研究報道，我們推測MRSA ST239克隆株中的這一新的細胞壁錨定蛋白可能在MRSA ST239菌株在醫(yī)院環(huán)境內(nèi)的持續(xù)感染中發(fā)揮重要的作用。我們將其命名為SasⅩ(Staphylococcus aureus surfaceproteinⅩ)

4、。本研究希望通過對這一新的細胞壁錨定蛋白SasⅩ在金黃色葡萄球菌中的分布特點、在定植和感染中的作用以及其作為疫苗研發(fā)新靶點的可行性進行研究，以期能夠明確MRSA ST239在醫(yī)院內(nèi)持續(xù)感染的分子機制，為抗金黃色葡萄球菌感染的新藥物或疫苗提供可能的研發(fā)靶點。
　　(1)新的細胞壁錨定蛋白SasⅩ的發(fā)現(xiàn)及其編碼基因在金黃色葡萄球菌中的分布
　　在中國以及亞洲其它國家醫(yī)院環(huán)境內(nèi)廣泛流行的MRSA克隆株為ST239菌株。通過對其基因

5、組的比對分析，我們發(fā)現(xiàn)了一段新的細胞壁錨定蛋白編碼序列，將其編碼的蛋白命名為SasⅩ。 SasⅩ與表皮葡萄球菌SesⅠ氨基酸同源性高達95％，通過對SesⅠ蛋白功能的研究，我們推測SasⅩ蛋白可能在金黃色葡萄球菌ST239克隆株在醫(yī)院環(huán)境內(nèi)持續(xù)感染中起到重要作用。本部分首先應用分子流行病學方法對sasⅩ基因進行分析。隨機收集中國華東地區(qū)三家教學醫(yī)院從2003年至2011年間共807株金黃色葡萄球菌菌株和來自社區(qū)健康人鼻腔定植的金黃色葡萄

6、球菌菌株170株進行了sasⅩ基因的擴增分析，發(fā)現(xiàn)sasⅩ主要存在于醫(yī)院環(huán)境內(nèi)致病性的金黃色葡萄球菌中，而在健康人鼻腔內(nèi)分離的金黃色葡萄球菌中sasⅩ的陽性率為0.59％。sasⅩ在ST239菌株中的陽性率持續(xù)上升，在其他克隆株中也逐漸出現(xiàn)sasⅩ陽性的菌株，如ST5、ST88等。通過對不同sasⅩ陽性的不同的克隆株中sasⅩ周圍基因環(huán)境的分析發(fā)現(xiàn)sasⅩ基因均存在于φSPβ樣原噬菌體中，這一結(jié)果提示攜帶sasⅩ基因的φSPβ樣原噬菌體

7、可以在不同克隆株之間傳播，從2003年-2005年至2009年-2011年，攜帶sasⅩ基因的MRSA比率從26.9％上升至45.2％，而攜帶sasⅩ基因的MSSA的比率只約占10％。通過分析臨床分離的sasⅩ陽性和sasⅩ陰性金黃色葡萄球菌對抗菌藥物的耐藥性差異提示sasⅩ基因的存在可能與細菌的耐藥有關。本部分的研究結(jié)果顯示，SasⅩ是金黃色葡萄球菌在醫(yī)院環(huán)境內(nèi)持續(xù)感染的毒力因子之一，sasⅩ可能在細菌的致病力中起到重要的作用。

8、>　　(2) SasⅩ在金黃色葡萄球菌生物膜形成和致病中的作用分析
　　采用基因敲除及基因互補技術(shù)獲得MRSA ST239 HS770菌株、HS605菌株和MRSA ST5 HS72菌株的sasⅩ基因敲除株及基因互補株。應用半定量生物膜形成實驗檢測sasⅩ基因敲除前后對金黃色葡萄球菌生物膜形成的影響，與野生株相比，sasⅩ基因敲除株生物膜形成能力明顯減弱。在進一步的初始粘附實驗中，sasⅩ基因敲除株粘附能力明顯減弱。SasⅩ可以通

9、過影響細菌的初始黏附從而影響生物膜的形成。使用小鼠的皮膚膿腫形成模型和肺炎模型研究SasⅩ對金黃色葡萄球菌毒力的影響。在小鼠皮膚膿腫形成模型中，實驗結(jié)果提示sasⅩ基因敲除前后均能引起小鼠皮膚膿腫的形成，但sasⅩ基因野生株接種小鼠皮膚膿腫形成面積在同一時間點上明顯大于sasⅩ基因敲除株，證明SasⅩ在小鼠皮膚膿腫中起到重要的作用;在小鼠肺炎模型中，sasⅩ基因野生株與其相應的敲除株相比較在濕肺組織/體重比值、由檢測TNF-α水平而鑒定

10、的肺組織中引起炎癥程度及病理切片觀察肺組織病變程度的結(jié)果均證明了SasⅩ在小鼠肺炎感染中起到一定的作用。細菌對于免疫系統(tǒng)的逃逸能力與其致病性密切相關，而中性粒細胞是機體抵抗細菌感染的主要效應細胞。sasⅩ基因敲除株比起其相應的攜帶有sasⅩ基因的臨床菌株具有更高的被中性粒細胞吞噬的機率。對于吞噬過程的研究顯示，野生株具有明顯的溶胞作用。sasⅩ基因能夠幫助細菌逃避宿主免疫系統(tǒng)的殺傷，促進細菌的致病性。
　　(3) SasⅩ在金黃色

11、葡萄球菌粘附聚集和定植中的作用分析
　　SasⅩ在生物膜形成中的作用提示SasⅩ可能在金黃色葡萄球菌的粘附聚集能力中起到重要的作用。使用普通顯微鏡直接觀察sasⅩ基因敲除前后細菌自身的粘附聚集能力發(fā)現(xiàn)，與野生株相比，sasⅩ基因敲除株自身的聚集能力明顯減弱，而互補表達株的自身聚集能力與野生株無明顯差異。金黃色葡萄球菌對于人類鼻腔表皮細胞的粘附在細菌的定植、播散和致病中有著重要的影響，鼻腔是金黃色葡萄球菌在人體中重要的定植部位。通過

12、粘附實驗檢測sasⅩ基因突變前后對金黃色葡萄球菌粘附至人體鼻腔上皮細胞的能力，并通過阻斷實驗檢測表達純化的SasⅩ蛋白對金黃色葡萄球菌粘附至人體鼻腔上皮細胞的阻斷能力，從而分析SasⅩ蛋白對金黃色葡萄球菌定植能力的影響。結(jié)果顯示，與野生株相比，突變株粘附至人體鼻腔上皮細胞能力明顯減弱，互補表達株粘附能力則明顯增強。表達純化的GST融合蛋白SasⅩ和人體鼻腔上皮細胞的預培養(yǎng)對于野生株粘附至人體鼻腔上皮細胞的能力具有明顯的抑制作用。作為鼻腔

13、定植的體內(nèi)實驗，小鼠鼻腔定植模型的結(jié)果顯示ST239和ST5的sasⅩ基因敲除株在小鼠鼻腔內(nèi)的定植能力比起其相應的野生株明顯下降。在sasⅩ基因野生株和基因敲除株的定植競爭實驗也顯示sasⅩ基因敲除株的定植能力明顯弱于野生株。研究結(jié)果表明，新的細胞壁錨定蛋白SasⅩ影響金黃色葡萄球菌粘附聚集和定植能力，金黃色葡萄球菌通過獲得sasⅩ基因更加容易定植到宿主易感部位，進而引發(fā)感染。
　　(4) SasⅩ作為金黃色葡萄球菌疫苗靶點可行性

14、的初步研究
　　通過對SasⅩ蛋白功能的研究結(jié)果顯示，這一新的細胞壁錨定蛋白是金黃色葡萄球菌的重要毒力因子。本部分以SasⅩ作為靶點通過主動免疫和被動免疫方式展開研究，以初步探索其是否具有成為研發(fā)抗金黃色葡萄球菌感染疫苗有效靶點的可行性。在小鼠的主動免疫實驗中，我們使用純化的SasⅩ重組蛋白與弗氏佐劑乳化后制成的疫苗免疫小鼠，對其血清進行檢測發(fā)現(xiàn)有高滴度的抗SasⅩ抗體產(chǎn)生，這說明SasⅩ蛋白具有很好的免疫原性，可以使被免疫小鼠產(chǎn)

15、生特異性的免疫應答。使用不完全佐劑加強免疫一周后特異性抗體滴度達到最高。特異性抗體第一次免疫后一周以IgG2a和IgG2b為主，不完全佐劑加強免疫一周IgG1升高成為濃度比例最高的抗體亞型。通過小鼠皮膚膿腫模型、小鼠肺炎模型以及小鼠菌血癥模型三個動物體內(nèi)模型顯示:以純化的SasⅩ蛋白與弗氏佐劑制成的疫苗免疫小鼠后，產(chǎn)生的特異性抗體具有明顯的免疫保護作用，組織炎癥反應及損傷程度和感染死亡率明顯降低。使用純化的SasⅩ重組蛋白與弗氏佐劑制成

16、的疫苗免疫兔子后，成功純化獲得含有抗SasⅩ的總IgG，用其進行的動物被動免疫體內(nèi)試驗顯示:較SasⅩ蛋白主動免疫動物相比，使用抗SasⅩ蛋白抗體被動免疫動物后抗感染能力與對照組未見顯著差異。所制備多抗的低活性是這一結(jié)果可能的原因之一。另外還需要增加實驗動物的數(shù)量以更好地評估抗SasⅩ多克隆抗體在免疫保護中的作用。該部分實驗結(jié)果初步提示SasⅩ蛋白作為金黃色葡萄球菌疫苗靶點具有一定的可能性，對這一新的細胞壁錨定蛋白在疫苗中的應用具有進一