1、實驗?zāi)康? 腦是人體對缺氧最為敏感的器官，腦組織缺血，將會導致局部腦組織及其功能的損害。微血管內(nèi)皮細胞是腦缺血性損害的重要靶點之一。微血管內(nèi)皮細胞是血腦屏障重要組成部分，缺血后的腦微血管內(nèi)皮細胞損傷直接導致血腦屏障破壞，引起腦血管通透性增高和血管源性腦水腫，并最終導致腦神經(jīng)細胞損傷。近年來，有學者提出了“神經(jīng)血管單元”的概念?！吧窠?jīng)血管單元”由神經(jīng)細胞、內(nèi)皮細胞、星形膠質(zhì)細胞三類主要細胞及位于它們周圍的維持大腦組織完整性的細胞外

2、基質(zhì)組成，在腦缺血后應(yīng)作為一個整體來綜合考慮。既往缺血性腦血管病的研究一直主要集中于神經(jīng)細胞，而對內(nèi)皮細胞的關(guān)注不夠。研究發(fā)現(xiàn)僅僅激活內(nèi)源性神經(jīng)再生的效果并不滿意，如果更加重視對內(nèi)皮細胞的保護，可能取得更好的臨床療效。所以，研究缺血后腦血管內(nèi)皮細胞的損傷機制并尋找出行之有效的減輕損害的方法，對于缺血性腦血管病的預(yù)防及治療有重要的意義。 中風病為現(xiàn)代醫(yī)學重大疾病之一，現(xiàn)代醫(yī)學治療尚不理想。由于對缺血性中風病急性期起關(guān)鍵作用的病理因

3、素和病理環(huán)節(jié)認識不同，中醫(yī)治療多強調(diào)祛痰、調(diào)化瘀、痰瘀同治、調(diào)通腑、清熱解毒；多以祛邪為主要治則，忽略了對人體正氣的顧護。為此，本課題組提出了中風病急性期的“扶正護腦”治則，主張在祛邪護腦治療的同時及早采用扶正固本法則，顧護人體正氣，拓寬了缺血性中風病急性期的中醫(yī)治療思路。在中風病急性期采用“扶正護腦”治則及其治法方藥，符合仲景“未虛先防，已虛防變”的治療思想。 中藥黨參，為扶正固本、益氣類的臨床常用代表藥。既往臨床和實驗研究證

4、實了桔梗科黨參及其成分有較好的腦保護作用，本實驗室以往研究證明黨參3種成分：黨參總皂苷、黨參皂苷L-1、黨參SFE提取物對大鼠腦神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞缺氧/缺糖損傷具有顯著保護作用。本課題采用大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞缺氧/缺糖模型模擬缺血損傷，以LDH、NO、SOD、MDA、細胞壞死率、凋亡率、凋亡蛋白酶活化等指標評價確定黨參3種成分：黨參總皂苷、黨參皂苷L-1、黨參SFE提取物對腦微血管內(nèi)皮細胞缺氧/缺糖損傷的影響，探討3種黨參成分對腦微血

5、管內(nèi)皮細胞缺氧/缺糖損傷的保護作用，并初步探索了其作用機制，為中風病急性期“扶正護腦”治則和中藥黨參成分用于中風病急性期臨床治療提供初步實驗依據(jù)，為中醫(yī)藥治療中風病急性期開辟了一個新的思路。 實驗方法: 1.原代分離、純化、培養(yǎng)大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞，并采用形態(tài)學、免疫細胞化學(Ⅷ因子相關(guān)抗原陽性)技術(shù)鑒定細胞。 2.通過形態(tài)學觀察和MTT實驗，檢測不同終濃度的黨參總皂苷、黨參皂苷L-1、黨參成分SFE提取物，分別

6、在正常培養(yǎng)狀態(tài)下對大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞活性的影響，并確定各藥物的最佳濃度。 3.采用化學方法檢測缺氧/缺糖損傷細胞上清液LDH漏出率(常規(guī)生化學方法)、N0(硝酸還原酶法)和MDA的含量(硫代巴比妥酸法)以及SOD的活力(黃嘌呤氧化酶法)。 4.采用Hoechst 33342和PI雙染法熒光顯微鏡檢測缺氧/缺糖損傷后不同終濃度的不同黨參成分對細胞的凋亡率和壞死率的影響。 5.采用免疫細胞化學方法和圖象半定量分析技

7、術(shù)測定缺氧/缺糖損傷后不同終濃度的不同黨參成分對大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞Caspase-3表達的平均光密度。 6.實驗結(jié)果采用SPSS40.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和方差分析。 結(jié)論: 大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞缺氧/缺糖模型能很好的模擬腦缺血損傷。缺氧/缺糖損傷能顯著提高細胞上清液LDH的漏出率、NO和MDA含量，同時能顯著降低SOD的活力；能夠顯著增加細胞的死亡率、凋亡率及凋亡蛋白酶Caspase-3的活性。而中藥黨參的有效成分

8、可以阻斷上述損傷機制，保護腦微血管內(nèi)皮細胞，減輕腦組織缺血/缺氧性的損傷。實驗結(jié)果說明：①黨參總皂苷中、低終濃度組，黨參皂苷L-1低終濃度組，黨參成分SFE提取物低終濃度組有顯著療效，與模型組比較；②黨參皂苷L-1中終濃度組，黨參成分SFE提取物中終濃度組也有療效，但不如上述組，與模型組比較；③黨參總皂苷高終濃度組，黨參皂苷L-1高終濃度組無保護作用，與模型組比較;④并且黨參成分SFE提取物高終濃度組可能還會加重缺氧/缺糖對大鼠腦微血管