1、本研究課題以大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞(cerebralmicrovascularendothelialcell，rCMEC)為研究材料，采用細胞生物學方法、分子生物學與生物物理檢測方法相結合，包括細胞培養(yǎng)的環(huán)境壓力和剪應力的調控、三維立體培養(yǎng)方式觀察血管生成、流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡、熒光定量PCR方法檢測VEGF的表達、原子力顯微鏡檢測粘性相關量和彈性相關量以及多元統(tǒng)計等方法，主要從以下幾個方面探討了生物力與藥物對于血管內(nèi)皮細胞血管生

2、成的影響。　　本實驗利用我室自己研制的可單獨調節(jié)壓力和剪應力的平板剪切裝置，采用多因素多水平試驗的高效設計方法——正交設計(orthogonaldesign)，通過在37℃、5％CO2條件下，對rCMEC施加不同水平的壓力、剪應力和川芎嗪16h，經(jīng)流式細胞術分析，觀察了壓力、剪應力和川芎嗪聯(lián)合作用對rCMEC細胞凋亡和細胞周期的影響，多元方差分析結果(表1-1)表明，壓力、剪應力和川芎嗪三因素以及它們之間的一級交互作用和二級交互作用均

3、有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，進一步經(jīng)一元方差分析表明，對細胞周期的各期及凋亡而言，各因素的二級交互作用均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，故各因素的主效應及其一級交互作用不再考慮，而以三因素的聯(lián)合作用為主。通過正交設計的方差分析綜合來看，凋亡最少的綜合條件是壓力0mmHg、剪應力10dyn/cm2、川芎嗪63μg/ml。在該條件下，處于S期細胞也在實驗數(shù)據(jù)的中上水平。2.壓力、剪應力與川芎嗪對rCMEC血管生成的影響本實驗采用重復測量設

4、計，利用Matrigel體外培養(yǎng)rCMEC的方法，對經(jīng)不同壓力、剪應力及川芎嗪作用16h后的rCMEC在Matrigel上的血管生成進行圖像分析，結果(表2-1)顯示對血管生成而言，兩種壓力、剪應力和川芎嗪組合(實驗1組與實驗2組)與對照之間的差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，且不同實驗條件下不同時間血管生成的差異亦有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。表明當相對壓力0mmHg、剪應力20dyn/cm2、川芎嗪63μg/ml時，血管生成旺盛，在

5、實驗時間段內(nèi)呈持續(xù)增長趨勢；而當相對壓力40mmHg、剪應力10dyn/cm2、川芎嗪126μg/ml時，血管生成緩慢，在實驗時間段內(nèi)先增長后緩慢下降，實驗結果提示生物力和藥物聯(lián)合作用對血管生成的影響不容忽視。　　本實驗利用前述實驗裝置，采用成組設計，通過在37℃、5％CO2條件下，對rCMEC施加不同水平的壓力、剪應力和川芎嗪16h，經(jīng)相對熒光定量PCR方法測定，以VEGF為目的基因(±argetgene)，β-actin為內(nèi)對照基

6、因(internalcontrolgene)，同時以對照組為校準(calibrator)，按Livak等的-△△CT方法來進行計算，觀察了壓力、剪應力和川芎嗪聯(lián)合作用對rCMECVEGF表達的影響，結果(表3-1)經(jīng)方差分析表明，當相對壓力0mmHg、剪應力20dyn/cm2、川芎嗪63μg/ml時，VEGF的表達是對照的4.44倍(P＜0.01)；而當相對壓力40mmHg、剪應力10dyn/cm2、川芎嗪126μg/ml時，VEGF的

7、表達卻僅是對照的0.16倍(P＜0.01)。這說明壓力、剪應力和川芎嗪三者不同的組合對VEGF表達的影響不同，可促進或抑制VEGF的表達，從而干預血管生成。　　本實驗利用前述實驗裝置，采用成組設計，通過在37℃條件下，對rCMEC施加不同水平的壓力、剪應力和替莫唑胺8h，經(jīng)流式細胞術分析，觀察了壓力、剪應力和替莫唑胺聯(lián)合作用對rCMEC細胞凋亡和細胞周期的影響，結果(表4-1)經(jīng)方差分析表明，對凋亡的影響而言，兩種條件即相對壓力42m

8、mHg、剪應力20dyn/cm2和替莫唑胺0μmol/L以及相對壓力0mmHg、剪應力30dyn/cm2和替莫唑胺300μmol/L與對照比較均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，而對細胞周期的各期而言，卻無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)?？赡苁且驗槲覀冊诩羟袑嶒灂r玻片上的細胞生長24h已經(jīng)鋪滿，90％以上的細胞處于G0G1期，因而形成了類似細胞同步化的現(xiàn)象；或者是剪切導致的關卡效應，使細胞周期停留在G1-S轉變期，G0/G1期細胞比例增加，S和

9、G2/M期細胞比例下降，同時出現(xiàn)了凋亡亞二倍體峰，提示細胞凋亡的發(fā)生與剪切延緩細胞周期轉換有關，但尚不能判斷凋亡細胞具體主要來源于細胞周期的何期，仍需進一步研究?！　”緦嶒灢捎镁鶆蛟O計，利用Matrigel體外培養(yǎng)rCMEC的方法，對經(jīng)不同壓力、剪應力及替莫唑胺作用8h后的rCMEC在Matrigel上的血管生成進行測量，3因素8水平共進行8次實驗，結果(表5-1)經(jīng)統(tǒng)計學處理得到多元回歸方程如下：y=2332978.20-4346.

10、21X3+403.38X1X2-717.32X2X2+83.86X2X3經(jīng)方差分析證明方程有意義，驗證實驗也表明方程的擬合程度亦較好。從方程可知：對于降低血管生成而言，替莫唑胺與剪應力作用為主。對于促進血管生成而言，壓力與剪應力有聯(lián)合作用，剪應力與替莫唑胺的聯(lián)合作用則較小。促進血管生成的優(yōu)化組合是相對壓力42mmHg、剪應力11.8dyn/cm2和替莫唑胺0μmol/L，血管生成最大為2433012.84μm2；抑制血管生成的優(yōu)化組合是

11、相對壓力0mmHg、剪應力42dyn/cm2和替莫唑胺350μmol/L，血管生成最小為779210.38μm2?！　”緦嶒灷们笆鰧嶒炑b置，采用成組設計，通過在37℃條件下，對rCMEC施加不同水平的壓力、剪應力和替莫唑胺8h，經(jīng)相對熒光定量PCR方法測定，按Livak等的-△△CT方法來進行計算，觀察了壓力、剪應力和替莫唑胺聯(lián)合作用對rCMECVEGF表達的影響，結果(表6-1)經(jīng)方差分析表明，當相對壓力42mmHg、剪應力20d

12、yn/cm2、替莫唑胺0μmol/L時，VEGF的表達是對照的6.01倍(P＜0.01)；而當相對壓力0mmHg、剪應力30dyn/cm2、替莫唑胺300μmol/L時，VEGF的表達卻僅是對照的0.11倍(P＜0.01)。說明壓力、剪應力和替莫唑胺三者不同的組合對VEGF表達的影響不同，或促進或抑制VEGF的表達。同時我們還觀察了壓力、剪應力和替莫唑胺聯(lián)合作用對rCMEC粘彈性的影響，通過使用生物型原子力顯微鏡對rCMEC成像后，選擇

13、細胞膜的不同部位，實施力曲線至飽和，從記錄的AmplitudevsDistance曲線上計算粘性相關量和彈性相關量，結果(表6-2)顯示兩實驗組K值均比對照組明顯增大(P＜0.01)，且兩種處理之間的差別亦顯著(P＜0.01)；但實驗組和對照組的△S值變化無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。提示經(jīng)相對壓力42mmHg、剪應力20dyn/cm2、替莫唑胺0μmol/L處理8h和經(jīng)相對壓力0mmHg、剪應力30dyn/cm2、替莫唑胺300μmo