1、第一部分 內(nèi)含子載體質(zhì)粒的構(gòu)建和擴(kuò)增 目的：采用分子生物學(xué)方法，運(yùn)用軟件設(shè)計(jì)的可動(dòng)性Ⅱ類內(nèi)含子位點(diǎn)和引物構(gòu)建變形鏈球菌comC基因和luxS基因內(nèi)含子質(zhì)粒載體，并且擴(kuò)增產(chǎn)T7RNA酶的質(zhì)粒pAR1219，為下一步轉(zhuǎn)導(dǎo)變形鏈球菌、失活comC基因和luxS基因打下基礎(chǔ)。 方法：根據(jù)軟件設(shè)計(jì)結(jié)果，comC基因選取兩個(gè)靶定位點(diǎn)設(shè)計(jì)，luxS基因選取三個(gè)分值最高的靶定位點(diǎn)設(shè)計(jì)，合成相應(yīng)的引物，采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的方法突變

2、Ⅱ類內(nèi)含子模板，連接產(chǎn)物到線性pACD4K-C質(zhì)粒中，形成環(huán)狀質(zhì)粒。將pACD4K-C質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)到大腸桿菌中擴(kuò)增，擴(kuò)增后用雙酶切電泳的方法鑒定質(zhì)粒。 結(jié)果：在五種位點(diǎn)設(shè)計(jì)中，內(nèi)含子模板突變產(chǎn)物電泳圖均能顯示三條條帶，分別長(zhǎng)350bp、300bp、100bp，主要目的片斷為350bp。擴(kuò)增后的pACD4K-C質(zhì)粒雙酶切后凝膠電泳顯示350bp和7kb兩條條帶，且質(zhì)粒穩(wěn)定復(fù)制，質(zhì)粒構(gòu)建成功。 結(jié)論：comC基因的兩種靶定插入位

3、點(diǎn)設(shè)計(jì)和luxS基因的三種靶定位點(diǎn)設(shè)計(jì)都能夠成功構(gòu)建內(nèi)含子載體質(zhì)粒。 第二部分 內(nèi)含子載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化變形鏈球菌失活目的基因的實(shí)驗(yàn)研究 目的：將兩種質(zhì)粒同時(shí)轉(zhuǎn)導(dǎo)到變形鏈球菌，誘導(dǎo)內(nèi)含子的表達(dá)并插入到comC基因和luxS基因的靶定位點(diǎn)中，分別構(gòu)建comC基因和luxS基因失活株。 方法：同時(shí)轉(zhuǎn)導(dǎo)pACD4K-C質(zhì)粒和pAR1219質(zhì)粒到變形鏈球菌中，通過(guò)氯霉素和氨芐青霉素的雙重抗性篩選，獲得具有雙重抗性的變型鏈球菌。通過(guò)I

4、PTG誘導(dǎo)pAR1219質(zhì)粒表達(dá)T7RNA酶，后者再誘導(dǎo)pACD4K-C質(zhì)粒內(nèi)含子的表達(dá)，靶定插入到基因位點(diǎn)中，通過(guò)接種在卡那霉素篩選培養(yǎng)基上，篩選出內(nèi)含子成功插入到基因組中的變型鏈球菌菌落，再用colony-PCR法鑒定內(nèi)含子的正確靶定插入。 結(jié)果：在五種靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)中，轉(zhuǎn)導(dǎo)pACD4K-C質(zhì)粒和pAR1219質(zhì)粒后的變形鏈球菌均能篩選出抗25 ug/ml氯霉素和50 ug/ml氨芐青霉素的抗性菌，提示質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)成功。 I

5、PTG誘導(dǎo)作用后，卡那霉素篩選BHI平板上可見(jiàn)按照五種位點(diǎn)設(shè)計(jì)構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)的變形鏈球菌中均有抗卡那霉素菌落生成。colony-PCR反應(yīng)確認(rèn)內(nèi)含子有無(wú)正確插入靶基因位點(diǎn)，在comC基因的兩種設(shè)計(jì)中，只有68/69位點(diǎn)的設(shè)計(jì)有目的條帶生成， luxS基因的三種設(shè)計(jì)中，只有132/133位點(diǎn)設(shè)計(jì)能夠擴(kuò)增出目的條帶。 結(jié)論：運(yùn)用可動(dòng)性Ⅱ類內(nèi)含子插入目的基因的方法可以高效地獲得穩(wěn)定的變形鏈球茵comC基因和luxS基因失活株，為進(jìn)一步