1、研究背景：
　　腫瘤多藥耐藥(multi-drug resistance，MDR)在相當(dāng)一部分接受化療的腫瘤患者中都有發(fā)生，這一現(xiàn)象的出現(xiàn)嚴(yán)重影響化療藥物的療效及腫瘤患者的預(yù)后。順鉑是治療頭頸腫瘤最有效的鉑類藥物之一，它通過與DNA交聯(lián)來干擾細(xì)胞分裂、誘導(dǎo)凋亡，從而殺滅腫瘤細(xì)胞。在臨床上常用順鉑聯(lián)合其他化療藥物治療腫瘤患者，但隨之出現(xiàn)的多藥耐藥現(xiàn)象使得順鉑的療效大大降低。鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,N

2、PC)是中國南部及東南亞地區(qū)最常見的惡性腫瘤之一，在很大一部分接受順鉑化療的中晚期鼻咽癌患者中同樣存在多藥耐藥現(xiàn)象。
　　腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells，CSCs)是存在于腫瘤組織中的一小部分具有干細(xì)胞性質(zhì)的細(xì)胞群體，它具有自我更新的能力，是形成不同分化程度腫瘤細(xì)胞和腫瘤不斷擴(kuò)大的源泉。腫瘤干細(xì)胞往往處于細(xì)胞分裂的靜止期，并且可以有效地將藥物排出胞外?，F(xiàn)有治療腫瘤的方法主要是針對(duì)腫瘤組織內(nèi)的大多數(shù)增殖迅速的分化細(xì)胞

3、，而無法殺滅腫瘤干細(xì)胞。在停止治療后，腫瘤干細(xì)胞的再度活躍將導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)。
　　化學(xué)治療過程中出現(xiàn)的多藥耐藥現(xiàn)象是導(dǎo)致化療失敗的主要原因，如何解決這一問題是目前抗腫瘤研究的熱點(diǎn)，其中尋找多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑(resistance reversal agents，RRA)是解決MDR問題的有效手段之一。流行病學(xué)研究結(jié)果顯示，綠茶對(duì)多種腫瘤均有防癌抗癌作用，其有效成分表沒食子素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate，

4、EGCG)能通過多種途徑抑制腫瘤的形成、生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，并對(duì)肝癌MDR細(xì)胞具有一定的逆轉(zhuǎn)作用。
　　本課題是以鼻咽癌細(xì)胞為研究對(duì)象，通過體外誘導(dǎo)建立了人鼻咽癌耐藥細(xì)胞系，并探討其耐藥機(jī)制;然后進(jìn)一步利用EGCG聯(lián)合化療藥物作用于耐藥細(xì)胞系，如能有效逆轉(zhuǎn)鼻咽癌細(xì)胞耐藥，則可為解決臨床上鼻咽癌患者多藥耐藥問題提供了一個(gè)可能的新途徑。
　　研究方法：
　　1、順鉑敏感細(xì)胞株的篩選:通過MTT實(shí)驗(yàn)篩選對(duì)化療藥物順鉑較敏感的人鼻咽癌

5、細(xì)胞株做為本課題實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象。
　　2、耐藥細(xì)胞系的建立及耐藥特征分析:采用大劑量沖擊和逐步增加藥物劑量相結(jié)合的方法誘導(dǎo)建立人鼻咽癌耐藥細(xì)胞系;MTT法分別檢測(cè)藥物對(duì)親代細(xì)胞及耐藥細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(half inhibitory concentration，IC50)，并計(jì)算耐藥指數(shù)(resistance index，RI);倒置顯微鏡下對(duì)比觀察親代細(xì)胞及耐藥細(xì)胞的形態(tài)學(xué)差異;通過流式細(xì)胞術(shù)(fluorescence activ

6、ated cell sorting，F(xiàn)ACS)分別檢測(cè)親代細(xì)胞和耐藥細(xì)胞的細(xì)胞周期。
　　3、交叉耐藥:通過MTT實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)長(zhǎng)春新堿、氟尿嘧啶、紫杉醇、氨甲蝶呤、多柔比星及阿糖胞苷等細(xì)胞毒藥物對(duì)親代細(xì)胞及耐藥細(xì)胞的敏感性，分析所建立的鼻咽癌耐藥細(xì)胞系的多藥耐藥性。
　　4、相關(guān)蛋白表達(dá)水平的檢測(cè):通過Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)親代細(xì)胞和耐藥細(xì)胞中耐藥相關(guān)蛋白及上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變(Epithelial-Mesenchym

7、al Transition，EMT)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。
　　5、耐藥相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平的檢測(cè):實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real time quantitative PCR，QPCR)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)親代細(xì)胞和耐藥細(xì)胞之間的耐藥相關(guān)基因的表達(dá)水平。
　　6、鼻咽癌耐藥細(xì)胞的腫瘤干細(xì)胞特性分析:通過流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)親代細(xì)胞和耐藥細(xì)胞中側(cè)群(side population，SP)細(xì)胞的比例，Aldefluor法檢測(cè)ALDHl+細(xì)胞

8、的多少和無血清懸浮培養(yǎng)法檢測(cè)兩組細(xì)胞腫瘤球形成率的高低。
　　7、EGCG逆轉(zhuǎn)耐藥效率的檢測(cè):通過MTT法檢測(cè)逆轉(zhuǎn)劑EGCG逆轉(zhuǎn)鼻咽癌細(xì)胞耐藥的效率，并計(jì)算其逆轉(zhuǎn)倍數(shù)(reversal factor,RI)。
　　8、逆轉(zhuǎn)耐藥機(jī)制的分析:通過對(duì)比檢測(cè)單一用藥及聯(lián)合逆轉(zhuǎn)劑用藥后耐藥細(xì)胞中細(xì)胞凋亡比例的改變，檢測(cè)SP細(xì)胞及ALDHl+細(xì)胞比例變化。
　　9、相關(guān)蛋白的表達(dá)水平檢測(cè):Western blot法檢測(cè)單一用藥和聯(lián)

9、合逆轉(zhuǎn)劑后耐藥細(xì)胞中腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志蛋白及多藥耐藥相關(guān)蛋白的水平變化。
　　研究結(jié)果：
　　1、6株人鼻咽癌細(xì)胞株對(duì)化療藥物順鉑的敏感性各不相同，其中CNE2細(xì)胞株對(duì)順鉑較為敏感，其半數(shù)抑制濃度為（0.62±0.04）μmol/L，能在含有低濃度順鉑的培養(yǎng)基中緩慢生長(zhǎng)，因此選擇CNE2細(xì)胞株做為本實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象。
　　2、建立了人鼻咽癌順鉑耐藥細(xì)胞系CNE2/CR，順鉑對(duì)耐藥細(xì)胞系的半數(shù)抑制濃度最終為（25.2±0.60

10、）μmol/L，其耐藥指數(shù)(resistance index，RI)為40;在形態(tài)學(xué)方面，與親代細(xì)胞對(duì)比，耐藥細(xì)胞胞體相對(duì)較小，呈均一的梭形，并伸出偽足，貼壁能力減弱，傳代時(shí)胰酶消化時(shí)間縮短;Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)EMT相關(guān)蛋白，結(jié)果顯示與親代細(xì)胞對(duì)比，耐藥細(xì)胞中E-cadherin、cytokeratin降低，N-cadherin、vimentin升高，提示耐藥細(xì)胞發(fā)生上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變。細(xì)胞周期檢測(cè)提示耐藥細(xì)胞較親代細(xì)胞G1

11、期細(xì)胞比例升高，S期、G2期細(xì)胞比例降低，耐藥細(xì)胞較親代細(xì)胞的增殖指數(shù)(proliferation index，PI)降低;CNE2/CR對(duì)細(xì)胞毒藥物紫杉醇、氟尿嘧啶、長(zhǎng)春新堿、氨甲蝶呤及阿霉素存在不同程度的耐藥，而對(duì)阿糖胞苷的敏感性略有增加。
　　3、QPCR檢查耐藥相關(guān)基因mRNA水平，結(jié)果表明與親代細(xì)胞對(duì)比，耐藥細(xì)胞系中MDR1/P-gp明顯升高，ABCC2略有升高，ABCC1、ABCG2降低。Western blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)

12、一步驗(yàn)證耐藥細(xì)胞系中耐藥相關(guān)蛋白MDR1/P-gp升高、ABCG2降低。
　　4、FACS檢測(cè)結(jié)果顯示耐藥細(xì)胞較親代細(xì)胞的SP細(xì)胞比例明顯升高，二者比例分別是13.9％和1.2％，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;耐藥細(xì)胞中ALDH1+細(xì)胞比例亦明顯增高;腫瘤球形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與親代細(xì)胞對(duì)比，耐藥細(xì)胞的腫瘤球形成率較高，所形成的腫瘤球體積更大;Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示耐藥細(xì)胞中腫瘤干細(xì)胞相關(guān)蛋白β-catenin、c-Myc表達(dá)水

13、平升高。
　　5、單藥EGCG對(duì)親代細(xì)胞和耐藥細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度分別為156.95μmol/L和105.70μmol/L;對(duì)比檢測(cè)單一順鉑用藥及聯(lián)合EGCG用藥對(duì)CNE2/CR的抑制效率，結(jié)果表明順鉑對(duì)CNE2/CR的IC50由31.05μmol/L降至1.41μmol/L。
　　6、用AnnexinV-FITC試劑盒檢測(cè)EGCG對(duì)細(xì)胞凋亡的作用。單藥EGCG濃度分別設(shè)置0、60、180μmol/L。分別作用于CNE2和CN

14、E2/CR細(xì)胞，兩組細(xì)細(xì)胞凋亡比例分別為3.4％、5.7％、14.0％及8.2％、14.5％、51.3％;進(jìn)一步對(duì)比檢測(cè)單一用藥及聯(lián)合EGCG用藥對(duì)細(xì)胞凋亡比例的影響，結(jié)果顯示聯(lián)合用藥后耐藥細(xì)胞凋亡比例明顯增加，凋亡率分別為5.9％（ctrl組）、16.2％（EGCG組）、74.7％(EGCG&DDP組)。
　　7、單藥EGCG濃度分別設(shè)置0、60、180μmol/L作用于耐藥細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SP細(xì)胞比例分別為17.2％、0.

15、4％、0％;單藥EGCG濃度分別設(shè)置為0、5、10、20、30μmol/L作用于耐藥細(xì)胞的腫瘤球，腫瘤球的形成率依次降低，所成腫瘤球體積依次變小;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示EGCG作用組中ALDHl+細(xì)胞比例明顯下降;進(jìn)一步對(duì)比單一EGCG用藥和聯(lián)合用藥后耐藥細(xì)胞中SP細(xì)胞的比例依次為12.3％（ctrl組）、5.3％（EGCG組）、1.8％（EGCG&DDP組）;Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與單一用藥組對(duì)比，聯(lián)合用藥后CNE2/C

16、R細(xì)胞中腫瘤干細(xì)胞相關(guān)蛋白β-catenin、c-Myc明顯降低。
　　8、Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白組對(duì)比，單一EGCG用藥組及聯(lián)合用藥組中耐藥相關(guān)蛋白MDR1/P-gp均降低，且后者降低更明顯。
　　研究結(jié)論：
　　1、成功建立了人鼻咽癌順鉑耐藥細(xì)胞系CNE2/CR，細(xì)胞體外培養(yǎng)和細(xì)胞周期檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與CNE2相比，CNE2/CR的生長(zhǎng)速度減慢，增殖活性較弱，其處于G0/G1期的細(xì)胞比例顯著升高，S

17、期的比例顯著下降，而G2期的改變不明顯。
　　2、CNE2/CR對(duì)細(xì)胞毒藥物紫杉醇、氟尿嘧啶、長(zhǎng)春新堿、氨甲蝶呤及阿霉素存在交叉耐藥，而對(duì)阿糖胞苷的敏感性略有增加;QPCR證明CNE2/CR細(xì)胞系中耐藥相關(guān)基因MDR1/P-gp的mRNA較親代細(xì)胞升高;Western blot實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)多藥耐藥相關(guān)蛋白MDR1/P-gp顯著升高。因此，CNE2/CR耐藥細(xì)胞系存在多藥耐藥性，耐藥機(jī)制與MDR1/P-gp耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)增加有關(guān)

18、。
　　3、耐藥細(xì)胞CNE2/CR形態(tài)學(xué)的改變及Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示耐藥細(xì)胞中Ecadherin、Cytokeratin降低，Ncadherin、Vimentin升高;這些結(jié)果表明CNE2/CR發(fā)生上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變，這可能也是CNE2/CR產(chǎn)生耐藥的機(jī)制之一。
　　4、流式細(xì)胞術(shù)對(duì)比檢測(cè)親代細(xì)胞及耐藥細(xì)胞中SP細(xì)胞及ALDH1+細(xì)胞的比例，結(jié)果顯示耐藥細(xì)胞中SP細(xì)胞及ALDH1+細(xì)胞比例明顯增加;進(jìn)一步

19、腫瘤球培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)顯示耐藥細(xì)胞的腫瘤球形成率更高，所形成的腫瘤球體積更大，這些實(shí)驗(yàn)證明CNE2/CR耐藥細(xì)胞的形成是一個(gè)富集腫瘤干細(xì)胞的過程。
　　5、隨著EGCG藥物濃度的升高，耐藥細(xì)胞凋亡比例增加，而腫瘤球的形成率下降，腫瘤球體積變小;通過這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明EGCG對(duì)耐藥細(xì)胞抑制作用具有劑量依賴性。
　　6、通過MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)順鉑單一用藥和聯(lián)合EGCG后兩組半數(shù)抑制濃度IC50分別為31.05μmol/L、1.41μmol/L

20、,該實(shí)驗(yàn)證明EGCG能有效逆轉(zhuǎn)CNE2/CR耐藥，其逆轉(zhuǎn)指數(shù)RI為22。
　　7、聯(lián)合EGCG逆轉(zhuǎn)劑作用后耐藥細(xì)胞的凋亡率明顯增加，該實(shí)驗(yàn)證明EGCG有效逆轉(zhuǎn)CNE2/CR的耐藥機(jī)制可能是通過促進(jìn)耐藥細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的。
　　8、聯(lián)合EGCG逆轉(zhuǎn)劑作用后，耐藥細(xì)胞中SP細(xì)胞的比例明顯降低，進(jìn)一步的Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)腫瘤干細(xì)胞相關(guān)蛋白β-catenin、c-Myc均明顯降低，該實(shí)驗(yàn)證明EGCG逆轉(zhuǎn)人鼻咽癌細(xì)胞耐藥的機(jī)