1、研究背景：
　　 許多急性或慢性肝病的終末期,死亡率非常高,治療十分棘手。目前,原位肝移植已成為臨床上治療終末期肝病的主要手段,但由于供體肝的缺乏等問題,使這一治療措施舉步維艱。因此,細(xì)胞移植治療終末期肝病是當(dāng)前研究的熱點(diǎn),采用肝細(xì)胞移植可望提高療效,但存在肝細(xì)胞來源缺乏的問題。近年來,干細(xì)胞的無限增殖能力及多向分化潛能使其成為產(chǎn)生肝細(xì)胞治療終末期肝病的一個(gè)肝外來源。許多實(shí)驗(yàn)研究證明大鼠和人不同組織來源的干細(xì)胞在體內(nèi)、外能誘導(dǎo)分

2、化為肝樣細(xì)胞。可供選擇的干細(xì)胞包括胚胎干細(xì)胞(embryonic stemcells,ESCs)、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchyme stem cells,BMSCs)及脂肪干細(xì)胞(adipose tissue-derived stromal cells,ADSCs)等。由于ESCs來源有限而且受倫理道德及基因方面等問題困擾,不具有廣泛開展臨床應(yīng)用的可行性。BMSCs是臨床應(yīng)用性較好的成體干細(xì)胞,然而,BMS

3、Cs來源有限、抽取骨髓有創(chuàng),且患者難以接受,其廣泛應(yīng)用也受到限制。2001年Zuk等首次報(bào)道在成體脂肪中發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞以來,ADSCs逐漸成為一個(gè)重要的干細(xì)胞來源。ADSCs具有和BMSCs相似的表型和多向分化潛能,可以向脂肪細(xì)胞、肝樣細(xì)胞、成骨細(xì)胞及心肌細(xì)胞等分化。脂肪組織來源充足、取材容易,并且ADSCs分離培養(yǎng)簡便、體外增殖能力強(qiáng)。ADSCs還具有免疫抑制特性,這使其沒有免疫排斥風(fēng)險(xiǎn),可以用于自體移植、同種異體移植和異種移植。因此,A

4、DSCs更適合于臨床應(yīng)用,可以作為組織工程潛在最大的成體干細(xì)胞庫,給肝細(xì)胞移植治療終末期肝病的患者帶來了希望。
　　 干細(xì)胞治療療效的評價(jià)需要反映出移植的干細(xì)胞在體內(nèi)移植后的分化、分布、遷徙及歸巢情況。大量研究表明,MRI是無創(chuàng)、在體示蹤細(xì)胞的最佳手段。為了使移植的細(xì)胞在體內(nèi)突出顯示,必須在移植前進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)磁性對比劑標(biāo)記。目前最常用的磁性標(biāo)記物是超順磁氧化鐵(superparamagnetic iron oxide,SPIO)。

5、然而,未經(jīng)表面修飾的SPIO顆粒很難標(biāo)記干細(xì)胞。許多學(xué)者對干細(xì)胞的SPIO標(biāo)記方法作了深入研究。轉(zhuǎn)染劑(transfect agents,TAs)的出現(xiàn)是干細(xì)胞SPIO標(biāo)記的一個(gè)重大突破,使得干細(xì)胞的SPIO標(biāo)記工作簡單、易行。TAs包括脂質(zhì)體、多胺類物質(zhì)、樹枝狀物質(zhì)、硅化合物、硫酸魚精蛋白等。目前,應(yīng)用較多的是左旋多聚賴氨酸(poly-1-lysine,PLL)。SPIO標(biāo)記細(xì)胞移植到體內(nèi)后,由于SPIO中的氧化鐵納米粒子具有超順磁性

6、,通過干擾周圍磁場,T2WI或T2*WI呈低信號,從而使移植細(xì)胞與周圍組織區(qū)別開,可根據(jù)靶器官M(fèi)RI信號的改變判斷移植細(xì)胞的情況,但該標(biāo)記技術(shù)對干細(xì)胞的生長和分化影響存在爭議。所以,本實(shí)驗(yàn)利用ADSCs作為研究對象,通過對ADSCs誘導(dǎo)分化成肝樣細(xì)胞,同時(shí)檢測細(xì)胞活力和觀察ADSCs分化后細(xì)胞糖原儲存和ALB表達(dá),以探討SPIO標(biāo)記技術(shù)對ADSCs的生長以及分化成肝樣細(xì)胞的影響,為該技術(shù)在干細(xì)胞移植治療示蹤應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　

7、 研究目的：
　　 探討(1)大鼠ADSCs的原代分離、培養(yǎng)和鑒定；(2)轉(zhuǎn)染劑PLL介導(dǎo)SPIO標(biāo)記大鼠ADSCs的可行性及對干細(xì)胞活力的影響；(3)使用PLL介導(dǎo)SPIO標(biāo)記方法對大鼠.ADSCs向肝樣細(xì)胞分化潛能的影響。
　　 材料與方法
　　 1.大鼠ADSCs的分離、培養(yǎng)和鑒定。無菌條件下采集SD大鼠腹股溝脂肪組織,進(jìn)行原代ADSCs的分離、培養(yǎng)、鑒定和傳代。倒置顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察干細(xì)胞的生長過程。采用流

8、式細(xì)胞技術(shù)檢測干細(xì)胞表面標(biāo)記物CD29、CD45、CD44、CD34及CD31的表達(dá)。
　　 2.采用轉(zhuǎn)染劑PLL介導(dǎo)SPIO進(jìn)行大鼠ADSCs的磁探針標(biāo)記的可行性及其對標(biāo)記干細(xì)胞活力的影響。使用第一部分研究中培養(yǎng)的第三代(P3)干細(xì)胞。采用SPIO試劑為鐵羧葡氨,原始濃度為28mg/ml。無血清培養(yǎng)基加入SPIO(25μg/mL)和PLL(0.75μg/mL),室溫下置于搖床混勻30min(30r/min),然后加入有貼壁干細(xì)

9、胞且鋪滿瓶底約90％的培養(yǎng)瓶內(nèi),37℃、5％CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)12h,PBS洗滌標(biāo)記細(xì)胞3次,除去多余SPIO待用。普魯士藍(lán)染色定性檢測細(xì)胞內(nèi)SPIO標(biāo)記情況。0.25％胰蛋白酶消化細(xì)胞,臺盼蘭實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞活力(取細(xì)胞懸液50μl/孔+0.2％臺盼蘭50μl染色檢測細(xì)胞活力)。
　　 3.轉(zhuǎn)染劑PLL介導(dǎo)SPIO標(biāo)記大鼠ADSCs對其向肝樣細(xì)胞分化潛能的影響。本試驗(yàn)使用第二部分的方法對大鼠ADSCs進(jìn)行SPIO標(biāo)記,采用臺盼藍(lán)試驗(yàn)

10、檢測SPIO標(biāo)記細(xì)胞的活力,將標(biāo)記后的細(xì)胞進(jìn)行向肝樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)。誘導(dǎo)方法如下:P3大鼠ADSCs低糖DMEM+10％FBS+雙抗液中培養(yǎng),至細(xì)胞貼壁80％-90％時(shí)消化,以4×104/ml細(xì)胞濃度接種于六孔板；鋪板的細(xì)胞分四組:標(biāo)記誘導(dǎo)組、未標(biāo)記誘導(dǎo)組、標(biāo)記未誘導(dǎo)組及未標(biāo)記未誘導(dǎo)組；首先,四組全部換培養(yǎng)液:低糖DMDM、20ng/mlEGF、10ng/mlβ-FGF培養(yǎng)48h；然后,誘導(dǎo)組換成誘導(dǎo)培養(yǎng)液Ⅰ:10％FBS、低糖DMD

11、M、20ng/mlHGF、10ng/mlβ-FGF培養(yǎng)至第14d；再換成誘導(dǎo)培養(yǎng)液Ⅱ:10％FBS、低糖DMEM、20ng/mlHGF、1μmol/l地塞米松,培養(yǎng)至第21d；每3天換液一次。未誘導(dǎo)組則以完全培養(yǎng)基換液,每3d換液1次。在誘導(dǎo)過程中,分別在誘導(dǎo)前及誘導(dǎo)后7、14及21d采用糖原染色檢測分化后肝樣細(xì)胞內(nèi)糖原儲存,免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測肝樣細(xì)胞內(nèi)白蛋白(albumin,ALB)生成,以及RT-PCR鑒定肝樣細(xì)胞特定基因ALB的

12、表達(dá)。誘導(dǎo)后21d采用糖原染色和普魯士藍(lán)染色雙染對各組細(xì)胞進(jìn)行糖原及細(xì)胞內(nèi)鐵的檢測。
　　 結(jié)果
　　 1.大鼠ADSCs能在體外成功分離培養(yǎng)。經(jīng)流式細(xì)胞(Flow cytometry,FCM)檢測,細(xì)胞表達(dá)CD44占100％,CD29占99.9％,CD45僅占1.4％,CD34占7.8％,CD31占13.1％,表明分離的細(xì)胞表型均一。
　　 2.轉(zhuǎn)染劑PLL介導(dǎo)SPIO能簡單高效地對大鼠ADSCs進(jìn)行磁探針標(biāo)記

13、。光學(xué)顯微鏡下普魯士藍(lán)染色結(jié)果示干細(xì)胞胞漿內(nèi)見大量藍(lán)色顆粒,細(xì)胞標(biāo)記率接近100％。臺盼蘭染色結(jié)果顯示,標(biāo)記細(xì)胞的活力(92.98±0.588％)和未標(biāo)記細(xì)胞的活力(93.50±0.469％)之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性意義(t=1.683,P=0.123)。
　　 3.標(biāo)記誘導(dǎo)組與未標(biāo)記誘導(dǎo)組大鼠ADSCs均能成功分化為肝樣細(xì)胞,并具有肝細(xì)胞功能的特征。PAS染色發(fā)現(xiàn)標(biāo)記誘導(dǎo)組與未標(biāo)記誘導(dǎo)組干細(xì)胞在誘導(dǎo)后14d分別可見細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)

14、紫紅色顆粒,為PAS染色陽性,誘導(dǎo)21d后,兩組細(xì)胞PAS染色強(qiáng)陽性,即出現(xiàn)紫紅色顆粒的細(xì)胞增多。誘導(dǎo)21d后,PAS染色+普魯士藍(lán)染色的雙染可見標(biāo)記誘導(dǎo)組細(xì)胞胞漿內(nèi)見紫紅色糖原顆粒,少數(shù)細(xì)胞內(nèi)見藍(lán)色鐵顆粒。標(biāo)記未誘導(dǎo)組少數(shù)細(xì)胞胞漿內(nèi)可見藍(lán)色鐵顆粒。未標(biāo)記誘導(dǎo)組細(xì)胞漿內(nèi)見紫紅色糖原顆粒。向肝樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化14d、21d,通過免疫細(xì)胞化學(xué)染色觀察,兩組細(xì)胞胞漿內(nèi)存在棕色ALB顆粒。誘導(dǎo)分化后7d、14d、21d,RT-PCR顯示標(biāo)記誘導(dǎo)組

15、與未標(biāo)記誘導(dǎo)組分別在14d可見ALB基因的表達(dá),且21d時(shí)ALB表達(dá)增強(qiáng),并且分別在14d及21d,ALB mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性意義(P>0.05)。上述結(jié)果初步表明,SPIO標(biāo)記對ADSCs分化為肝樣細(xì)胞無明顯影響。
　　 結(jié)論
　　 本研究表明體外分離培養(yǎng)大鼠ADSCs具有可行性、可重復(fù)性。ADSCs培養(yǎng)簡易,增殖能力強(qiáng),是一個(gè)重要的干細(xì)胞來源。采用轉(zhuǎn)染劑PLL介導(dǎo)SPIO可以簡單、高效地標(biāo)記大鼠ADSCs